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siRNA抑制PPARγ的表达对绒癌细胞JEG-3侵袭力的影响

作　者: 许华
导　师: 陈丽君
学　校: 山东大学
专　业: 妇产科学
关键词: 小分子RNA干扰过氧化物酶体增殖物激活型受体γ 黏蛋白MUC1 JEG-3 滋养细胞侵袭力
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

[研究背景及目的]过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(peroxisome proliferator activated receptors-gamma, PPARγ)属Ⅱ型核受体超家族成员,其功能较复杂,参与糖及脂肪代谢、单核细胞激活、炎症反应、细胞分化、增生和凋亡等生理病理过程。PPARγ在胎盘发育中是必需的,参与了滋养细胞的侵袭、增殖、迁移等过程,因而与生理及病理妊娠有着密切的联系。近年来许多研究显示子痫前期、胎儿生长受限及复发性自然流产等病理妊娠的发生均与滋养细胞的侵袭能力异常有关。本研究旨在利用小分子RNA干扰技术抑制PPARγ在人绒毛膜癌细胞株JEG-3中的表达,研究其对体外滋养细胞侵袭力的影响,探讨其参与调节滋养细胞侵袭的机制,为子痫前期、胎儿生长受限及复发性自然流产等病理妊娠的发病机制提供理论基础。[方法]1.常规复苏、培养人绒毛膜癌细胞株JEG-3至对数生长期备用。2.根据Genebank中PPARγ的序列号,设计并化学合成PPARγsiRNA,为3条特异性的PPARγsiRNA, S1,S2,S3;1条非特异性阴性对照siRNA,1条荧光标记的非特异性阴性对照siRNA。3.常规培养JEG-3细胞,种于六孔板中,将荧光标记的空白对照siRNA以终浓度分别为100nmol/L,50nmol/L转染细胞,用荧光电子显微镜观察其转染效率,选择转染siRNA的最佳浓度。4.常规培养JEG-3细胞,种于六孔板中,将实验①分为阴性对照组(转染阴性对照siRNA),S1组(转染PPARγ特异性siRNA中的S1链),S2组(转染PPARY特异性siRNA中的S2链),S3组(转染PPARγ特异性siRNA中的S3链),S4组(转染混匀的PPARγ特异性siRNA中的S1、S2、S3链),进行转染。5.采用实时定量PCR技术分别检测各组细胞转染后PPARγmRNA的水平,选择对PPARγ抑制效率最高的组。6.常规培养JEG-3细胞至对数生长期,种于六孔板中,将实验②分为实验组(转染PPARγ特异性siRNAS2链),阴性对照组(转染阴性对照siRNA),空白对照组(不转染任何siRNA,余试剂与其他两组相同),进行转染。7.采用实时定量PCR技术分别检测三组细胞转染后PPARγmRNA的水平,以检测siRNA对PPARγ的抑制率,并测定黏蛋白MUC1 mRNA的水平。8. Transwell细胞侵袭实验：将三组转染24小时后的细胞,用含10%胎牛血清(fetal cow serum,FCS)的培养液重悬,接种于包被matrigel基质胶的小室上室,下室加入含20%FCS的培养液,培养24小时后,常规HE染色,40倍显微镜下取5个视野计数穿膜细胞数,用于检测转染PPARγsiRNA后JEG-3细胞的侵袭力。9.统计学方法：应用SPSS 17.0软件包进行统计分析,以均数±标准差(X±s)表示定量资料数据,组间比较采用单因素方差分析,认为P<0.05有统计学意义。[结果]1.荧光电子显微镜下观察以终浓度为100nmol/L荧光标记的siRNA转染效率最高。2.转染24小时后,与阴性对照组相比,S1组PPARγmRNA水平下调了(40.88±1.05)%(p<0.05)；S2组PPARγmRNA水平下调了(71.92±0.71)%；S3组PPARγmRNA水平下调了(62.69±0.66)%；S4组PPARγmRNA水平下调了(52.8±0.52)%。得出S2组PPARγsiRNA的抑制效率最高。3.转染24小时后,与空白对照组相比,实验组PPARγmRNA的表达水平下调了(75±0.8)%(p<0.05),阴性对照组PPARγmRNA的表达无差异(p>0.05)。各组细胞中MUC1 mRNA的表达水平,实验组与空白组相比下调了(65±1.3)%(p<0.05),阴性对照组与空白对照组则无统计学差异(p>0.05)。4.与空白对照组相比,实验组转染PPARγsiRNA后,JEG-3细胞穿透Metrigel基质胶的细胞数显著增多,差异有统计学意义(p<0.05),阴性对照组与空白对照组比较则无统计学差异。[结论]siRNA技术能有效的抑制人绒毛膜癌细胞株JEG-3细胞中PPARγmRNA的表达,能够相应的下调MUC1 mRNA的表达,并能增强滋养细胞的侵袭能力,推测PPARγ基因可能通过调节MUC1基因影响滋养细胞的侵袭能力,从而参与了子痫前期等病理妊娠的发生。

全文目录

中文摘要  7-10
ABSTRACT  10-13
符号说明  13-14
第1章前言  14-17
第2章材料与方法  17-26
  2.1 实验材料  17-19
    2.1.1 实验主要仪器设备  17
    2.1.2 实验主要试剂  17-19
  2.2 实验方法  19-26
    2.2.1 细胞培养与传代  19-20
    2.2.2 siRNA的设计与合成  20
    2.2.3 荧光标记的siRNA转染JEG-3细胞  20-21
    2.2.4 siRNA转染JEG-3细胞  21
    2.2.5 实时定量PCR  21-23
    2.2.6 特异性靶向人PPAR_Y基因的siRNA的转染  23-24
    2.2.7 测定转染后细胞中PPAR_Y及MUC1 mRNA的水平  24
    2.2.8 Transwell小室侵袭实验  24-25
    2.2.9 统计学检验  25-26
第3章结果  26-27
  3.1 JEG-3细胞的siRNA的转染效率  26
  3.2 各组转染后细胞中PPAR_Y及MUC1 mRNA的表达情况  26
  3.3 各组转染后JEG-3细胞侵袭力的比较  26-27
第4章讨论  27-36
  4.1 早孕期滋养细胞的侵袭能力及其与病理妊娠的关系  27-28
  4.2 PPAR_Y的生物学结构、功能及其与病理妊娠的关系  28-32
  4.3 MUC1的生物学结构、功能及其与病理妊娠的关系  32-35
  4.4 问题与展望  35-36
第5章结论  36-37
附图  37-41
参考文献  41-48
攻读学位期间发表的学术论文  48-49
致谢  49-50
学位论文评阅及答辩情况表  50

siRNA抑制PPARγ的表达对绒癌细胞JEG-3侵袭力的影响

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