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疯草产苦马豆素内生真菌筛选及其发酵产物抑菌活性试验

作　者: 卢围
导　师: 赵宝玉
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 疯草 内生真菌 分离鉴定 苦马豆素 抑菌活性
分类号: S452
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


植物内生真菌是指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期内,生活于植物组织内部,而对宿主不引起明显疾病症状的一类真菌。研究发现,内生真菌的次生代谢产物中含有很多具有生物活性的物质。疯草是棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalas)两属有毒植物,动物采食后能够引起以神经机能紊乱为特征的中毒。苦马豆素(Swainsonine,SW)为疯草主要毒素,一种吲哚里西啶生物碱(indolizidine alkaloids),由于分离于苦马豆而得名。苦马豆素药用前景非常广阔,在很多药用领域潜力巨大,尤其是其抗肿瘤活性引起了国内外学者的广泛关注。通过对疯草内生真菌的分离、鉴定以及发酵产物检测等研究发现,疯草中存在产苦马豆素内生真菌,如埃里格孢菌(Embellisia sp.)等。本研究针对疯草灾害较为严重的内蒙古、青海和宁夏地区,采集小花棘豆、黄花棘豆、甘肃棘豆和变异黄芪。然后进行内生真菌分离、纯化、鉴定和菌种保藏。对内生真菌发酵产物进行成分分析,以期鉴定出产苦马豆素内生真菌,并以分离得到的内生真菌为发酵菌种,检测其发酵液和菌丝体不同极性段的抑菌活性,为我国疯草内生真菌的开发利用奠定基础。本研究取得如下成果:1.疯草产苦马豆素内生真菌筛选按照不同植物部位进行内生真菌分离、纯化和菌种保藏。采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(GC)对内生真菌发酵产物进行成分分析,薄层色谱法和气相色谱法的定性和定量检测结果显示有两株内生真菌的次生代谢产物中含有苦马豆素:XJ-H-1菌株发酵液中SW含量为16.7338 mg/L,XJ-J-1菌株发酵液中SW含量为4.2092 mg/L。2.产苦马豆素菌株的鉴定结合菌落、菌丝以及孢子的形态学观察和真菌5.8SrDNA-ITS序列测定分析,对两株产苦马豆素内生真菌进行鉴定。两株产苦马豆素内生真菌在形态学上存在微小差异,但在5.8SrDNA-ITS序列水平上完全相同,同源性高达100%。XJ-J-1和XJ-H-1与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)比对同源性高达99%。通过系统发育树分析,这两株产苦马豆素内生真菌与层出镰刀菌的亲缘关系较近,自检支持率高达90%。结合《真菌鉴定手册》的形态学描述,提示XJ-H-1(XJ-J-1)为层出镰刀菌。3.内生真菌发酵产物抑菌活性研究通过对上步试验分离鉴定出的产苦马豆素内生真菌—层出镰刀菌生物发酵,依次采用石油醚、氯仿,乙酸乙酯和正丁醇(体积比1:1)萃取内生真菌的发酵产物,制备药敏片。经KB,MIC和MBC试验测定其发酵液和菌丝体不同极性段的抑菌活性。结果显示:层出镰刀菌发酵液的乙酸乙酯极性段具有良好的抑菌活性,对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为1.660 cm,1.984 cm,1.902 cm,1.902 cm。对其MIC分别为0.39 mg/mL,3.125 mg/mL,1.56 mg/mL,0.78 mg/mL。对其MBC分别为3.125 mg/mL,12.5 mg/mL,6.25 mg/mL,6.25 mg/mL。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
前言  12-13
文献综述  13-38
  第一章 植物内生真菌研究进展  13-26
    1.1 植物内生真菌定义及研究历史  13-14
    1.2 植物内生真菌的生物多样性  14-16
      1.2.1 普遍存在性  14-15
      1.2.2 物种多样性  15-16
    1.3 植物内生真菌的生态学意义  16-18
      1.3.1 提高宿主植物的抗逆性  16-17
      1.3.2 促进植物的生长  17-18
    1.4 植物内生真菌次生代谢产物研究  18-23
      1.4.1 内生真菌次生代谢产物研究技术路线  19
      1.4.2 抗菌物质研究  19-20
      1.4.3 抗病毒物质研究  20
      1.4.4 抗癌肿瘤物质研究  20-21
      1.4.5 杀虫类物质研究  21-22
      1.4.6 促进和抑制植物生长类物质研究  22-23
      1.4.7 其它活性物质的研究  23
    1.5 目前内生真菌研究存在的问题  23-25
      1.5.1 内生真菌的分离方法有待改进  23-24
      1.5.2 植物内生真菌的来源及感染途径仍不明确  24
      1.5.3 关于内生真菌与植物之间的相互作用机理研究较少  24
      1.5.4 内生真菌阴性感染对照组难以建立  24-25
    1.6 内生真菌研究展望  25-26
      1.6.1 内生真菌次生代谢产物研究展望  25
      1.6.2 内生真菌抗逆性研究展望  25
      1.6.3 内生真菌研究方法改进展望  25
      1.6.4 内生真菌基础性研究展望  25-26
  第二章 疯草及其毒素苦马豆素研究进展  26-38
    2.1 疯草的定义与种类分布  26-28
    2.2 疯草对畜牧业的危害  28-30
      2.2.1 影响家畜繁殖  28-29
      2.2.2 降低动物的生产性能  29
      2.2.3 造成家畜大批中毒死亡  29
      2.2.4 促使草场退化  29-30
    2.3 疯草灾害的防治技术  30-32
      2.3.1 疯草传统防治方法  30-31
      2.3.2 疯草生态控制技术  31-32
    2.4 疯草毒素苦马豆素研究进展  32-36
      2.4.1 苦马豆素研究历史  32-33
      2.4.2 苦马豆素理化特性  33
      2.4.3 苦马豆素的药理学活性及应用  33-34
      2.4.4 苦马豆素来源研究  34-36
    2.5 疯草及其毒素苦马豆素研究展望  36-38
试验研究  38-60
  第三章 疯草产苦马豆素内生真菌的分离与筛选  38-47
    3.1 试验材料与主要仪器试剂  38-40
      3.1.1 实验材料  38
      3.1.2 主要仪器  38
      3.1.3 主要试剂  38-40
    3.2 试验方法  40-42
      3.2.1 疯草内生真菌的分离纯化与菌种保藏  40-41
      3.2.2 疯草内生真菌的生物发酵  41
      3.2.3 疯草内生真菌发酵产物中苦马豆素检测前处理  41
      3.2.4 发酵液和菌丝体样品中苦马豆素薄层色谱定性检测  41
      3.2.5 发酵液和菌丝体样品中苦马豆素气相色谱定性检测  41-42
    3.3 试验结果  42-45
      3.3.1 疯草内生真菌分离结果  42-43
      3.3.2 疯草内生真菌发酵结果  43-44
      3.3.3 发酵提取液的苦马豆素薄层色谱定性检测结果  44-45
      3.3.4 发酵液及菌丝体中苦马豆素气相色谱检测结果  45
    3.4 讨论  45-46
      3.4.1 疯草内生真菌分离  45-46
      3.4.2 影响疯草内生真菌生物发酵产苦马豆素的因素  46
    3.5 小结  46-47
  第四章 产苦马豆素菌株的鉴定  47-54
    4.1 试验材料与主要仪器试剂  47-48
      4.1.1 试验材料  47
      4.1.2 主要仪器  47
      4.1.3 主要试剂  47-48
    4.2 试验方法  48-50
      4.2.1 真菌的形态学鉴定  48
      4.2.2 真菌的分子生物学鉴定  48-50
    4.3 试验结果  50-51
      4.3.1 菌落形态学观察结果  50-51
      4.3.2 真菌5.851DNA-ITS 序列扩增及序列测定结果  51
      4.3.3 真菌5.851DNA-ITS 序列系统进化树构建结果  51
    4.4 讨论  51-53
      4.4.1 真菌的形态学鉴定  51-52
      4.4.2 5.851DNA-ITS 序列用于真菌的基因水平鉴定  52-53
    4.5 小结  53-54
  第五章 内生真菌发酵产物抑菌活性初筛  54-60
    5.1 试验材料与主要仪器试剂  54
      5.1.1 试验材料  54
      5.1.2 主要仪器  54
      5.1.3 主要试剂  54
    5.2 试验方法  54-56
      5.2.1 真菌发酵产物的极性段萃取与浓缩  54-55
      5.2.2 浓缩液除菌与药敏片制备  55
      5.2.3 抑菌活性检测  55-56
    5.3 试验结果  56-58
    5.4 讨论  58-59
      5.4.1 生物发酵液处理中生物活性的保持  58
      5.4.2 层出镰刀菌抑菌活性评价  58-59
    5.5 小结  59-60
结论  60-61
参考文献  61-68
附录  68-78
致谢  78-79
作者简介  79

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 有害植物及其清除 > 毒草
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