学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

肿瘤细胞表面聚糖的电化学检测与细胞成像分析

作　者: 薛亚东
导　师: 鞠熀先
学　校: 南京大学
专　业: 分析化学
关键词: 扫描电化学显微镜单细胞分析细胞活性细胞高度聚糖凝集素内源性指示剂细胞传感器微图案化仿生界面生物相容性亲水性反馈模式产生收集模式循环伏安法示差脉冲伏安法电化学阻抗逼近曲线微米电极纳米电极玻碳电极 K562白血细胞 BGC-823胃癌细胞碳纳米管梭基二茂铁甲醇基二茂铁聚二甲基硅氧烷层层组装
分类号: R730.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 400次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

细胞是生命体的基本单位,对细胞结构和功能的深入研究是人类征服疾病的关键。细胞膜上的聚糖分子通过与蛋白质和脂类缀合形成糖缀合物而影响蛋白和脂类的功能,介导和调控细胞黏附行为。更重要的是,糖缀合物结构和功能可以主导恶性肿瘤的许多生长特性及侵袭转移能力。因此,原位特异性检测细胞表面活性聚糖,对于揭示糖基化在细胞生理活动中的作用,开发癌症治疗的新方法具有重要的意义。传统研究方法一般是以大量细胞为研究对象,用平均结果反映单个细胞的化学信息。然而,由于生物组织中各种化学成分分布及细胞本身的个体差异性,大量细胞分析常常得出不准确甚至错误的结论。因此直接分析单个细胞的化学成分和生理状态十分重要。本论文结合纳米技术、电化学技术、和化学生物学实现了对细胞表面聚糖的原位电化学检测,研究了药物对细胞表面聚糖表达的影响；并进一步结合扫描电化学显微镜技术和微米／纳米加工技术在单细胞水平上对细胞表面聚糖和凋亡行为进行了图像学监测。本论文主要包括以下四个部分：1.凝集素功能化碳纳米管与细胞表面聚糖动态表达的无标记监测本工作以聚二烯丙基二甲基氯化铵作为连接剂,将凝集素非共价地组装在羧基化的多壁碳纳米管(MWCNTs)表面,构建了一种凝集素功能化的MWCNTs (lectin-MWCNTs)。用扫描电子显微镜、原子力显微镜和接触角分析仪表征了所得新型纳米材料的均一性和生物相容性。该材料同时具有凝集素对细胞表面糖基的特异性识别能力和MWCNTs独特的电子和机械性能。通过在玻碳电极表面构建一层lectin-MWCNTs界面,我们首先发展了一种无标记的电化学细胞传感方法,它对K562细胞检测的线性响应范围为1.0×104至1.0×107cells mL-1。这种细胞传感方法还能用来监测药物处理后,K562细胞表面聚糖表达的动态变化。通过构建lectin-MWCNTs阵列,进一步发展了一种简便的高通量活细胞表面聚糖动态表达分析的光学方法,具有令人满意的速度和低成本。凝集素对碳纳米管的非共价功能化有望用于细胞表面糖基相关的细胞生物学研究。2.电化学凝集素探针的构建与细胞均相传感和表面糖基原位检测通过碳二酰亚胺偶合反应,共价构建了二茂铁-伴刀豆球蛋白A (Fc-ConA)电化学凝集素探针。该探针同时具有凝集素对糖基的特异性识别能力和二茂铁基团良好的电化学性能。利用得到的Fc-ConA探针设计了一种简便的均相细胞传感策略,用以检测白血病K562细胞。在细胞浓度1×104至1×107 cells mL-1范围内线性相关性良好,并且在3σ时计算其检测限为3×103 cells mL-1。由于ConA对细胞表面甘露糖基的特异性识别作用,该凝集素探针还能用以方便估算细胞表面的甘露糖基数目,并测得平均每个K562细胞表面的甘露糖基数约为3×1010个。该策略可进一步用于监测药物作用下细胞表面糖基数目的变化,且得到的细胞表面糖基变化跟传统的流式细胞仪检测结果相吻合。这一策略为细胞的均相灵敏传感和监测细胞对药物应答时表面糖基的表达水平提供了一个有力的平台。3.以氧气为内源性指示剂实时监测细胞纳米级高度变化与活性本工作以氧气作为内源性指示剂,发展了一种SECM实时监测单细胞纳米级高度变化的方法,并间接实现了细胞活性的评估。首先,通过将穿有铂丝的石英毛细管放入硼硅玻璃管中拉制,得到纳米铂盘电极,该电极具有均匀的锥形尖端,最小半径可达5 nm。以铂纳米电极作为SECM探针,在恒高度模式下可以清晰地对磷酸盐生理缓冲液中单个BGC细胞周围的氧气浓度变化进行电化学成像。考虑到引起该浓度变化的原因包括多种因素,本论文设计了一种" step-approaching "策略将总电流变化中归属于反馈电流的部分分离出来,并将此方法应用于研究单个细胞长期的高度变化。SECM测量结果显示BGC细胞暴露于25℃磷酸盐生理缓冲液中2h内的高度变化为55-365 nm(n=8)。经AnnexinⅤ-FITC凋亡试剂盒染色证实,细胞凋亡是引起细胞高度变化的主要原因。因此,所提出的SECM方法可以间接对细胞的活性进行实时监测,以紫杉醇作为模型药物的药敏试验成功验证了本方法监测细胞活性的实用性。本文提供了一种在近生理环境无外源性指示剂下监测活细胞纳米级高度变化的策略,并可用于细胞活性的评估。4.微图案化的单个贴壁细胞表面聚糖的原位电化学成像以人胃癌BGC-823细胞为模型,发展了一种基于SECM的对单个贴壁细胞表面四种聚糖进行原位成像的方法。首先,通过将这些贴壁细胞在聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜的微孔里图案化,精确地控制局部表面的相互作用,然后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的凝集素对细胞表面相应的糖基进行特异性的识别。SECM探针是直径2微米的铂盘电极,通过激光拉制的方法制备而成,具有良好的电化学性能。基于HRP催化H202氧化甲醇基二茂铁(FMA)生成FMA+这一酶催化反应,通过测量SECM针尖上FMA+的还原电流实现了细胞表面糖基的检测。因此,SECM方法无需将贴壁细胞从培养皿底部消化脱落,便可在单细胞水平上对细胞表面的聚糖进行成像。在优化条件下,SECM得到的四种糖基的表达水平显示出统计学上的差异,并且与流式细胞仪的结果相一致。该方法为单细胞水平原位研究活细胞表面糖基化水平提供了一个有力的平台,并有望用于细胞表面糖基表达相关的生物学研究。

全文目录

中文摘要  10-13
英文摘要  13-17
本文的主要创新点  17-18
第一章绪论  18-53
  §1.1 细胞图像分析  18-34
    1.1.1 扫描电化学显微镜技术  19-28
      1.1.1.1 扫描电化学显微镜的工作原理  20-21
      1.1.1.2 扫描电化学显微镜的实验装置  21-23
      1.1.1.3 单细胞的扫描电化学显微镜研究  23-28
    1.1.2 光学显微镜细胞图像分析  28-32
      1.1.2.1 明场显微镜  29
      1.1.2.2 荧光显微镜  29
      1.1.2.3 激光共聚焦显微镜  29-30
      1.1.2.4 多光子荧光显微镜  30-32
    1.1.3 原子力显微镜  32-34
  §1.2 基于细胞的电化学传感器  34-41
    1.2.1 细胞的固定化方法  35-37
    1.2.2 细胞在新型生物纳米材料上的固定技术  37-38
    1.2.3 基于细胞电化学行为的传感器  38-39
    1.2.4 基于细胞功能的电化学传感器  39
    1.2.5 基于细胞阻抗行为的电化学传感器  39-40
    1.2.6 研究趋势  40-41
  §1.3 细胞表面聚糖  41-46
    1.3.1 聚糖的定义、分类、组成和结构  41
    1.3.2 糖基化改变与疾病的相关性  41-42
    1.3.3 细胞膜表面聚糖检测的难点  42-43
    1.3.4 细胞膜表面聚糖检测技术  43-46
      1.3.4.1 质谱  43
      1.3.4.2 基于凝集素的技术  43-46
  §1.4 本论文的主要研究工作  46-48
  参考文献  48-53
第二章凝集素功能化碳纳米管用于细胞表面聚糖动态表达的无标记监测  53-67
  §2.1 引言  53-54
  §2.2 实验部分  54-58
    2.2.1 试剂  54-55
    2.2.2 细胞株和细胞培养  55-56
    2.2.3 仪器  56
    2.2.4 PDDA功能化MWCNTs的制备  56
    2.2.5 传感器的制备  56-57
    2.2.6 ConA-MWCNTs阵列的构建  57
    2.2.7 细胞计数  57
    2.2.8 单糖抑制实验  57
    2.2.9 流式细胞分析  57-58
  §2.3 结果与讨论  58-64
    2.3.1 ConA非共价功能化MWCNTs的表征  58-59
    2.3.2 基于ConA-MWCNTs的电化学细胞传感  59-61
    2.3.3 利用ConA-MWCNTs和细胞表面聚糖特异性结合捕获细胞  61-62
    2.3.4 监测细胞表面糖基表达的无标记电化学方法  62-63
    2.3.5 细胞表面聚糖动态表达的无标记光学分析  63-64
    2.3.6 基于ConA-MWCNTs分析的重现性和稳定性  64
  §2.4 结论  64
  参考文献  64-67
第三章电化学凝集素探针及细胞均相传感与表面糖基原位检测  67-79
  §3.1 引言  67-68
  §3.2 实验部分  68-71
    3.2.1 试剂  68-69
    3.2.2 仪器  69
    3.2.3 细胞培养与细胞处理  69-70
    3.2.4 凝集素探针(Fc-ConA)的制备  70
    3.2.5 基于Fc-ConA探针的电化学分析  70
    3.2.6 流式细胞分析  70-71
  §3.3 结果与讨论  71-76
    3.3.1 FcCOOH和ConA共价结合的表征  71-72
    3.3.2 Fc-ConA探针的电化学性质  72-73
    3.3.3 基于Fc-ConA的电化学细胞传感  73-74
    3.3.4 K562细胞检测  74-75
    3.3.5 K562细胞表面糖基定量检测方法  75-76
  §3.4 结论  76-77
  参考文献  77-79
第四章以氧气为内源性指示剂实时监测细胞纳米级高度变化与活性  79-94
  §4.1 引言  79-80
  §4.2 实验部分  80-83
    4.2.1 试剂  81
    4.2.2 仪器  81
    4.2.3 纳米铂盘电极的制备  81-82
    4.2.4 细胞培养和准备  82-83
    4.2.5 单细胞SECM恒高度成像  83
    4.2.6 荧光实验监测细胞凋亡  83
    4.2.7 MTT试验  83
  §4.3 结果与讨论  83-91
    4.3.1 纳米铂盘电极的表征  84-85
    4.3.2 以氧气作为指示剂的单细胞SECM成像与复合SECM信号的分离  85-87
    4.3.3 PBS缓冲液中单个BGC细胞高度变化的时间序列  87-90
    4.3.4 紫杉醇对细胞高度变化的影响  90-91
  §4.4 结论  91-92
  参考文献  92-94
第五章微图案化的单个贴壁细胞表面聚糖的原位电化学成像  94-110
  §5.1 引言  94-96
  §5.2 实验部分  96-99
    5.2.1 试剂  96
    5.2.2 仪器  96-97
    5.2.3 铂盘微电极的制备  97
    5.2.4 细胞培养  97
    5.2.5 BGC细胞的微图案化  97-98
    5.2.6 SECM检测步骤  98-99
    5.2.7 流式细胞分析  99
  §5.3 结果与讨论  99-106
    5.3.1 铂盘微电极的表征  99-100
    5.3.2 细胞的图案化  100-101
    5.3.3 细胞表面糖基与HRP标记凝集素的特异性识别  101-102
    5.3.4 HRP标记凝集素浓度与识别时间的优化  102-103
    5.3.5 优化检测条件  103-104
    5.3.6 单个贴壁BGC细胞表面聚糖的SECM成像  104-105
    5.3.7 BGC细胞表面四种类型聚糖的原位电化学成像  105-106
  §5.4 结论  106-107
  参考文献  107-110
附录  110-113
致谢  113-114

肿瘤细胞表面聚糖的电化学检测与细胞成像分析

内容摘要

全文目录

相似论文