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几种抗病毒药剂对烟草花叶病毒的抑制作用及相关机理研究

作　者: 李红霞
导　师: 曹克强
学　校: 河北农业大学
专　业: 植物病理
关键词: 抗病毒制剂没食子酸烟草花叶病毒TMV 抑制作用诱导抗性
分类号: S435.72
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)为防治对象,以普通烟草为模式植物,采用生物学方法测定了一些生物化学药剂、寡糖、真菌多糖、中草药提取物对TMV的抑制作用,结果表明,五倍子乙醇提取物(Gallis Phois,GP)、香菇多糖和中草药单一组分DM002对TMV有明显的抑制作用,其中五倍子乙醇提取物的抗病毒活性最高;进一步探索了五倍子粗提物中主要活性成分对烟草花叶病毒的抑制作用,发现抗病毒活性最高的有效成分为没食子酸(Gallic Acid,GA),并建立了五倍子提取物、香菇多糖与DM002混剂(AB)对植物病毒病的抗病模式: (1)用10%五倍子提取物喷施烟草幼苗,2d后接种TMV,对烟草花叶病毒病的防治效果达到82.48%;(2)用110μg/ml AB混剂(A:B=10:1)喷施烟草幼苗,2d后接种TMV ,间隔7d后再用药,对烟草花叶病毒病的防治效果达到70.02%。用该抗病模式进行田间示范试验,结果表明,10%五倍子提取物和110μg/ml AB混剂对番茄病毒病(TMV和CMV混合侵染型)的田间防治效果分别为91.29%和73.04%,明显高于常规对照药剂20%病毒A可湿性粉剂(61.55%),明显增强了番茄对病毒病的抗性。香菇多糖、中草药单一组分DM002和没食子酸等抗病毒药剂对烟草花叶病毒的增殖具有明显的抑制作用。用实时定量RT-PCR方法反转录合成病毒核酸(TMV-RNA),结果发现,各试验药剂均在不同程度上抑制了病毒核酸(TMV-RNA)的合成;用醋酸法提取TMV外壳蛋白亚基(TMV-CP),与各药剂混合后在10℃～39℃范围内测定在320nm处的吸光值,结果发现,各试验药剂在不同程度上影响了病毒外壳蛋白的体外聚合作用。由此可知,没食子酸不仅可有效抑制病毒核酸(TMV-RNA)的合成,还明显影响病毒衣壳蛋白亚基(TMV-CP)的聚合,干扰植物病毒的正常组装,有效地控制了病毒的复制。植物的保护反应是复杂的新陈代谢结果,其生理反应是通过酶催化活动来实现的。本研究发现香菇多糖、DM002、没食子酸等药剂可改善苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase, PAL)活性,诱导烟草增强了过氧化物酶(peroxidase, POD)、几丁质酶(Chitinase)和β-1,3-葡聚糖酶等抗病防御酶的活性,增加了富含羟脯氨酸糖蛋白(hydroxyproline-richglycoprotein,HRGP)含量,诱导了烟草对烟草花叶病毒TMV的抗性。因此,从植物生理生化学角度揭示了植物体内对抗病防御酶影响较大的抗病毒物质---没食子酸可以作为有效激发子,诱导寄主植物产生对植物病毒病的抗性。PRs蛋白的产生被认为是植物产生诱导抗病性的生化机制之一,而PR1-a基因是植物产生系统诱导抗病性SAR的标志基因。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE-SDS)方法检测了胞间病程相关蛋白PRs的表达与烟草花叶病毒TMV在植物体内增殖的关系。结果表明,没食子酸可诱导烟草在受TMV侵染后的蛋白表达接近正常植株的表达水平,而香菇多糖和DM002处理烟草后接种TMV的烟草叶片表达的PRs与单独接种TMV处理间的差异不显著;本研究还用半定量RT-PCR技术反转录合成了PR1-a基因,结果表明,香菇多糖、DM002和没食子酸均能诱导烟草体内PR1-a基因的表达,但是三者之间存在一定的差异,其中没食子酸诱导烟草PR1-a量明显高于其它药剂。由此推测,没食子酸可以作为一种重要的诱导抗病剂诱导烟草植株体内病程相关蛋白PRs的差异表达。由此说明,没食子酸作为一种重要的诱导抗病剂诱导烟草植株体内病程相关蛋白PRs差异表达,使植株产生对植物病毒病的抗病性。?

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
引言  12-22
  1 抗植物病毒病的生防药剂  13-16
    1.1 生化农药的开发与利用  13
    1.2 植物根围促生细菌  13-14
    1.3 天然产物抗病毒药剂  14-16
      1.3.1 来源于微生物的抗病毒药剂  14-15
      1.3.2 植物源抗病毒药剂  15-16
  2 植物抗病毒药剂的作用机理  16-22
    2.1 直接抵抗病毒  16-17
      2.1.1 抑制病毒的侵染  16-17
      2.1.2 抑制病毒的增殖和转运  17
      2.1.3 抑制病毒症状的表达  17
    2.2 间接抵抗病毒---诱导植物的抗病性  17-22
      2.2.1 诱导次生代谢物质的合成  19
      2.2.2 生物防御酶的作用  19-20
      2.2.3 病程相关蛋白  20-22
第一章抗病毒药剂的筛选与复配  22-34
  1 材料与方法  22-25
    1.1 材料  22-23
      1.1.1 供试烟草品种  22
      1.1.2 供试病毒毒源  22
      1.1.3 主要仪器  22
      1.1.4 供试药剂  22-23
      1.1.5 对照化学抗病毒制剂  23
    1.2 方法  23-25
      1.2.1 中草药提取物的制备  23
      1.2.2 测定化学物质、寡糖、中草药单一组分等抗病毒药剂对烟草体内TMV 的抑制作用  23-24
      1.2.3 测定中草药提取物对TMV 的抑制作用  24
      1.2.4 验证抗病毒活性较强的候选药剂对TMV 的抑制作用  24-25
  2 结果与分析  25-34
    2.1 寡糖和化学物质对TMV 的抑制作用  25-26
    2.2 真菌多糖对烟草花叶病毒病TMV 的抑制作用  26-27
    2.3 中草药提取物和中草药单一组分对烟草花叶病毒病TMV 的抑制作用  27-31
      2.3.1 中草药提取物对TMV 的体外抑制作用  27-28
      2.3.2 中草药提取物对烟草花叶病毒TMV 体内增殖的抑制作用  28-30
      2.3.3 中药材单一组分对烟草花叶病毒病TMV 的抑制作用  30-31
    2.4 验证抗病性较理想的药剂对TMV 的抑制作用效果  31-32
    2.5 五倍子提取物中主要单一组份及部分衍生物对TMV 的抑制作用  32-34
      2.5.1 五倍子提取物中主要单一组分及部分衍生物对TMV 的体外抑制作用  32-33
      2.5.2 五倍子提取物中主要单一组分及部分衍生物对TMV 的抑制作用效果  33-34
第二章抗病毒制剂活性成分的复配及建立抗病毒药剂对TMV的抗病模式  34-42
  1 材料和方法  34-36
    1.1 材料  34
      1.1.1 烟草花叶病毒及试验植物  34
      1.1.2 试验药剂  34
    1.2 方法  34-36
      1.2.1 香菇多糖(A) 与中草药单一组分DM002 (B) 的复配组合，筛选最佳配比  34-35
      1.2.2 建立香菇多糖与DM002 对TMV 的抗病毒模式  35
      1.2.3 五倍子单一组分单宁酸(C) 与没食子酸(D) 的复配组合，筛选最佳配比  35
      1.2.4 建立五倍子提取物对TMV 的抗病毒模式  35
      1.2.5 试验小样品的田间示范试验  35-36
  2 结果与分析  36-42
    2.1 香菇多糖(A)与中草药单一组分DM002 (B)  36-37
      2.1.1 优化复配筛选  36-37
      2.1.2 植物抗病毒模式的建立  37
    2.2 五倍子提取物对TMV 的抑制作用  37-40
      2.2.1 五倍子提取物中单一组分间的优化复配  37-38
      2.2.2 建立五倍子提取物对烟草上TMV 的抗病毒模式  38-40
    2.3 田间示范试验防治番茄病毒病  40-42
第三章抗病毒药剂对烟草花叶病毒复制的影响  42-48
  1 材料和方法  42-46
    1.1 材料  42-43
      1.1.1 抗病毒药剂  42
      1.1.2 供试毒源  42
      1.1.3 试验器材  42-43
      1.1.4 主要试验试剂  43
    1.2 方法  43-46
      1.2.1 抗病毒药剂对TMV 外壳蛋白合成的影响  43
      1.2.2 抗病毒药剂对TMV-RNA 合成的影响  43-46
  2 结果与分析  46-48
    2.1 抗病毒药剂对烟草花叶病毒外壳蛋白（TMV-CP）体外聚合作用的影响  46-47
      2.1.1 TMV 的精提纯效果  46
      2.1.2 抗病毒制剂对TMV-CP 体外聚合过程的影响  46-47
    2.2 抗病毒药剂对烟草花叶病毒核酸（TMV-RNA）的影响  47-48
第四章抗病毒制剂对烟草花叶病毒TMV抗病的生理生化机理  48-66
  1 材料和方法  49-56
    1.1 材料  49
      1.1.1 供试毒源  49
      1.1.2 供试植物  49
      1.1.3 供试药剂  49
      1.1.4 试验主要仪器  49
      1.1.5 试验药剂  49
    1.2 试验环境  49-50
    1.3 方法  50-56
      1.3.1 药剂预处理及烟草花叶病毒TMV 的接种  50
      1.3.2 粗酶液提取  50
      1.3.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）活性的测定  50-51
      1.3.4 几丁质酶活性的测定  51
      1.3.5 β-1,3 葡聚糖酶活性的测定  51-52
      1.3.6 富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP）含量的测定  52-53
      1.3.7 抗病毒药剂处理后的烟草叶片中胞间隙蛋白(PRs) 聚丙烯酰胺电泳SDPAGE  53-54
      1.3.8 烟草叶片中病程相关蛋白基因PR-1a 的表达  54-56
  2 结果与分析  56-66
    2.1 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性变化  56-57
    2.2 过氧化物酶（POD）活性变化  57-58
    2.3 几丁质酶（CHITINASE）活性变化  58-59
    2.4 Β—1,3 葡聚糖酶活性变化  59-61
    2.5 富含羟脯氨酸的糖蛋白（HRGP）含量的变化  61-62
    2.6 抗病毒药剂处理后的烟草叶片中胞间隙蛋白(PRS) SDS-PAGE 电泳图谱变化  62-64
      2.6.1 接种TMV 后7 d 时烟草叶片中病程相关蛋白的表达  62-63
      2.6.2 接种TMV 后14 d 时烟草烟草叶片中病程相关蛋白PRs 的表达  63
      2.6.3 接种TMV 后21d 时烟草烟草叶片中病程相关蛋白的表达  63-64
    2.7 抗病毒药剂对烟草叶片中PR-1A 基因表达的影响  64-66
第五章讨论  66-72
  1 关于抗病毒药剂的筛选与复配  66-67
  2 关于抗病毒制剂活性成分的复配及建立抗病毒药剂对TMV 抗病体系  67-68
    2.1 AB 混剂和五倍子提取物的防治特点  67-68
    2.2 抗病毒药剂的开发前景  68
  3 抗病毒药剂对烟草花叶病毒复制的影响  68-69
    3.1 抗病毒药剂对烟草花叶病毒衣壳蛋白(TMV-CP)的体外聚合的影响  68-69
    3.2 抗病毒药剂对烟草花叶病毒核酸(TMV-RNA) 合成的影响  69
   4 关于抗病毒制剂对烟草花叶病毒TMV抗病的生理生化机理  69-72
    4.1 抗病毒制剂对烟草体内防御酶等抗病性指标的影响  69-70
    4.2 抗病毒药剂对烟草体内病程相关蛋白表达的影响  70-72
结论  72-73
参考文献  73-80
在读期间已发表文章  80-81
作者简历  81-82
致谢  82-83

几种抗病毒药剂对烟草花叶病毒的抑制作用及相关机理研究

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