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肉制品和乳制品中致病菌检测技术体系建立及李氏菌分型鉴定与溯源研究

作　者: 王耀
导　师: 曹远银
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 有害生物与环境安全
关键词: 肉制品乳制品致病菌 DNA聚合酶链式反应变性高效液相色谱基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
分类号: TS252.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

肉制品和乳制品中的多种致病菌是影响食品安全和威胁人类身体健康的重要因素。目前国内外对肉制品和乳制品中致病菌的检测方法还多停留在检测效率低、目标单一的水平上。本研究采用DNA聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)高通量检测方法,对肉制品和乳制品中多种致病菌的高通量检测、属种鉴定、血清分型、流行株检测等检测技术进行了系统研究,搭建相应技术平台。并且通过应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS),对单核细胞增生性李斯特氏菌的鉴定分型和溯源进行了系统的研究。本研究取得的试验结果如下：1.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了针对肉制品中常见的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、D溶血性链球菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O157：H7、致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌等10种致病菌的单一致病菌的PCR-DHPLC检测方法,并且建立了可以同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、β溶血性链球菌等六种致病菌的多重PCR-DHPLC高通量同步检测方法和四种致泻性大肠杆菌的多重PCR-DHPLC高通量同步检测方法。2.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了乳制品中常见的阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌、致病性嗜水气单胞菌等8种致病菌的各单一致病菌的快速高通量检测方法。并且建立了可同时检测阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌等四种致病菌的多重PCR-DHPLC检测方法以及奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌、致病性嗜水气单胞菌等四种致病菌的多重PCR-DHPLC检测方法。3.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,通过设计并筛选出特异性的引物,在菌属的水平上,建立了食品中李斯特氏菌属的PCR-DHPLC快速检测方法。4.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了食品中李氏菌三种致病菌即单核细胞增生性李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌的多重PCR-DHPLC高通量检测方法。5.在国内外首次应用PCR结合DHPLC技术,建立了食品中单核细胞增生性李斯特氏菌血清型中临床感染率高的主要血清型(1/2a和4b)的分型多重PCR-DHPLC高通量检测方法。6.以单核细胞增生性李斯特氏菌的流行株分类(ECⅠ、ECⅡ、ECⅢ)为检测对象,应用DHPLC的非变性条件下的鉴定技术,在流行株分类的水平上,在国内外首次建立了食品中单核细胞增生性李斯特氏菌流行株分类的高通量检测方法。7.以李斯特氏菌属的6个分类菌种(单核细胞增生性李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌、威尔斯李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌)为检测对象,应用DHPLC的部分变性条件下的高通量分型鉴定技术,在属以下的菌种分类水平上,在国内外首次建立了食品中李斯特氏菌属6个分类菌种的高通量分种鉴定方法。8.本研究收集了37株单核细胞增生性李斯特氏菌分离株,应用MALDI-TOF-MS采集获取独特的蛋白质指纹图谱,汇总成标准图谱,在国内外首次建立了单核细胞增生性李斯特氏菌鉴定数据库。并且在数据库信息的基础上,对37株单核细胞增生性李斯特氏菌分离株进行了聚类分型和溯源研究。综上所述,本研究在国内外首次建立了肉制品和乳制品中多种致病菌的PCR-DHPLC快速、精准、高通量同步检测技术体系,并且建立了单核细胞增生性李斯特氏菌的MALDI-TOF-MS鉴定数据库,开展了系统的单核细胞增生性李斯特氏菌的聚类分型和溯源研究。上述研究成果对于食源性致病菌的快速鉴定和主动监测以及重大食源性疾病的预防和溯源具有重要的意义。

全文目录

摘要  12-14
英文摘要  14-16
第一章文献综述  16-39
  1.1 食源性致病菌检测技术研究进展  16-28
    1.1.1 以生物化学手段建立的快速检测技术  16-17
    1.1.2 以免疫学方法建立的快速检测技术  17-19
    1.1.3 以核酸为基础的检测技术  19-23
    1.1.4 基于微生物代谢的检测技术  23-24
    1.1.5 传感器技术  24-25
    1.1.6 振动光谱技术  25-26
    1.1.7 小结与展望  26-28
  1.2 变性高效液相色谱法及其应用  28-33
    1.2.1 DHPLC基本原理  28-30
    1.2.2 DHPLC主要技术特点  30-31
    1.2.3 DHPLC应用  31-33
    1.2.4 展望  33
  1.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术及其应用  33-39
    1.3.1 质谱的基本概念及组成  33-34
    1.3.2 MALDI-TOF-MS工作原理及关键影响因素  34-35
    1.3.3 MALDI-TOF-MS应用  35-38
    1.3.4 展望  38-39
第二章肉制品中常见致病菌PCR-DHPLC高通量检测技术研究  39-79
  2.1 概述  39-47
    2.1.1 致泻性大肠埃希氏菌  39-41
    2.1.2 沙门氏菌  41-42
    2.1.3 金黄色葡萄球菌  42-43
    2.1.4 单核细胞增生性李斯特氏菌  43-44
    2.1.5 空肠弯曲菌  44-45
    2.1.6 溶血性链球菌  45-47
    2.1.7 小肠结肠炎耶尔森氏菌  47
  2.2 材料和方法  47-57
    2.2.1 材料  47-50
    2.2.2 方法  50-57
  2.3 结果与分析  57-77
    2.3.1 引物设计结果  57-59
    2.3.2 引物筛选结果  59-60
    2.3.3 PCR反应缓冲液的优化结果  60
    2.3.4 引物浓度的优化结果  60-61
    2.3.5 MgCl_2浓度的优化结果  61
    2.3.6 dNTP浓度的优化结果  61
    2.3.7 Taq酶用量的优化结果  61
    2.3.8 PCR退火温度和循环数优化结果  61
    2.3.9 单一致病菌的PCR产物电泳检测结果  61-62
    2.3.10 单一致病菌的PCR产物DHPLC检测结果  62-65
    2.3.11 单一致病菌DHPLC检测特异性试验结果  65-71
    2.3.12 单一致病菌DHPLC检测灵敏度检测结果  71-72
    2.3.13 可以同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和β溶血性链球菌六种食源性致病菌DHPLC检测方法的建立  72-74
    2.3.14 可以同时检测致泻大肠杆菌产肠毒素大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7、致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌DHPLC检测方法的建立  74-76
    2.3.15 可以同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和β溶血性链球菌六种食源性致病菌DHPLC检测方法特异性结果  76
    2.3.16 可以同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、空肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和β溶血性链球菌六种食源性致病菌DHPLC检测方法灵敏度结果  76-77
    2.3.17 可以同时检测产肠毒素大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7、致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌四种食源性致病菌DHPLC检测方法特异性结果  77
    2.3.18 可以同时检测产肠毒素大肠埃希氏菌、肠出血性大肠杆菌O_(157):H_7、致病性大肠杆菌和肠侵袭性大肠杆菌四种食源性致病菌DHPLC检测方法灵敏度结果  77
  2.4 小结  77-79
第三章乳制品中常见致病菌PCR-DHPLC高通量检测技术研究  79-102
  3.1 概述  79-82
  3.2 材料和方法  82-88
    3.2.1 材料  82-84
    3.2.2 方法  84-88
  3.3 结果与分析  88-100
    3.3.1 引物设计结果  88-89
    3.3.2 单一致病菌PCR-DHPLC检测结果  89-92
    3.3.3 单一致病菌PCR-DHPLC检测特异性结果  92-96
    3.3.4 多重PCR反应体系的建立  96-98
    3.3.5 多重PCR-DHPLC通用分析条件的建立与检测  98-100
  3.4 小结  100-102
第四章食品中李氏菌种属及血清分型与流行株DHPLC高通量检测技术研究  102-133
  4.1 概述  102-105
    4.1.1 李斯特氏菌属的分类简介  102-103
    4.1.2 李斯特氏菌属的血清学分型简介  103-104
    4.1.3 李斯特氏菌属的致病流行株简介  104-105
  4.2 材料和方法  105-108
    4.2.1 材料  105-107
    4.2.2 方法  107-108
  4.3 结果与分析  108-131
    4.3.1 引物设计结果  108-109
    4.3.2 PCR通用扩增条件优化结果  109
    4.3.3 DHPLC分析条件优化结果  109
    4.3.4 李斯特氏菌属检测的特异性试验结果  109-110
    4.3.5 李斯特氏菌致病菌种检测的特异性试验结果  110-113
    4.3.6 单核细胞增生性李斯特氏菌主要致病血清型检测的特异性试验结果  113-115
    4.3.7 单核细胞增生性李斯特氏菌致病流行株检测的特异性试验结果  115-116
    4.3.8 部分变性条件下李氏菌属六种分类菌种的高通量分种鉴定试验结果  116-129
    4.3.9 灵敏度试验结果  129-130
    4.3.10 精密度试验结果  130-131
  4.4 小结  131-133
第五章单核细胞增生性李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鉴定分型与溯源技术研究  133-152
  5.1 概述  133
  5.2 材料和方法  133-136
    5.2.1 材料  133-135
    5.2.2 方法  135-136
  5.3 结果与分析  136-150
    5.3.1 菌株收集结果  136-138
    5.3.2 培养基对细菌质谱检测的影响  138-139
    5.3.3 培养时间对细菌质谱检测的影响  139
    5.3.4 点样方法优化试验结果  139
    5.3.5 野生株鉴定数据库的建立  139-140
    5.3.6 野生株数据库鉴定结果及图谱  140-145
    5.3.7 新旧数据库鉴定结果比较  145-147
    5.3.8 溯源进化树的建立  147-148
    5.3.9 溯源图的建立  148-150
  5.4 小结  150-152
第六章结论与讨论  152-162
  6.1 结论  152-153
  6.2 讨论  153-162
    6.2.1 肉制品中常见致病菌PCR-DHPLC高通量同步检测技术的研究必要性及关键点  153-155
    6.2.2 乳制品中常见致病菌PCR-DHPLC高通量同步检测技术的研究必要性及关键点  155-157
    6.2.3 食品中李氏菌种属及血清分型与流行株PCR-DHPLC高通量检测技术的研究必要性及关键点  157-160
    6.2.4 单核细胞增生性李斯特氏菌MALDI-TOF-MS鉴定分型与溯源技术的研究必要性及关键点  160-162
参考文献  162-175
致谢  175-176
攻读博士学位期间发表文章  176

肉制品和乳制品中致病菌检测技术体系建立及李氏菌分型鉴定与溯源研究

内容摘要

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