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多聚ADP核糖聚合酶1在HepG2肝细胞内葡萄糖毒性中的作用及机制研究

作　者: 庞婧
导　师: 张铁梅
学　校: 北京协和医学院
专　业: 细胞生物学
关键词: 糖尿病胰岛素敏感性葡萄糖毒性氧化应激 PARPl NAD SIRTl
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景：糖尿病是以细胞外液持续高糖状态为特点的糖代谢紊乱性疾病。持续的细胞外高糖状态可以造成细胞内环境和成分的改变,这些细胞内的改变体现了细胞对外界环境变化所做出的反应,并与细胞功能调节密切相关。氧化应激产物生成增加和由此所致的生物大分子损伤是其中常见的改变。越来越多的证据表明高糖状态所产生的负性效应不仅与活性氧物质产生增加所致的细胞内生物大分子物质,包括脂质、蛋白质和DNA的直接损伤相关,而且与细胞为了抵御活性氧损伤所做出的调节反应相关。本研究即从细胞自身反应与细胞功能调节的角度出发,将由高糖状态引发活性氧生成增加导致的细胞内DNA损伤修复系统与胰岛素信号通路相联系,观察在高糖培养条件下HepG2细胞内DNA修复酶多聚ADP核糖聚合酶1(Poly(ADP-ribose) polymerase 1, PARP1)活化后所引发的一系列反应,以及最终对细胞胰岛素敏感性的影响,由此探讨一条新的葡萄糖毒性可能产生损伤的途径。方法：本研究选用人肝癌细胞系HepG2作为研究对象,以30mM葡萄糖培养HepG2细胞模拟高糖状态,5.5mM葡萄糖培养HepG2细胞作为对照组。通过DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧水平的生成情况；采用单细胞凝胶电泳法检测细胞内DNA损伤状况；各种蛋白表达水平及活性水平的检测均采用Western Blotting的方法；细胞内NAD含量的检测采用NAD/NADH检测试剂盒。采用PARP1抑制剂PJ34进行处理后观察PARP1活化后效应。结果：1)高浓度葡萄糖培养条件下HepG2细胞内活性氧生成显著增加(p<0.05),并呈缓慢积累趋势。与5.5mM葡萄糖培养相比,30mM葡萄糖培养HepG2细胞1天可增加活性氧生成量1.7倍,培养4天可增加活性氧生成量3倍(p<0.05),而糖渗透对照组并未引起细胞内活性氧的生成增多；活性氧清除剂NAC或活性氧抑制剂Apocynin与30mM葡萄糖共同作用可减少细胞内活性氧的生成(p<0.05)；与高糖诱导的缓慢积累效应所不同,化学刺激物Rosup诱导了快速强烈的活性氧生成过程。2)高浓度葡萄糖培养条件下HepG2细胞发生的氧化应激反应,造成了细胞内的DNA损伤,且损伤程度与活性氧生成量呈正相关。与5.5mM葡萄糖培养下的细胞相比,30mM葡萄糖培养HepG2细胞2天DNA损伤增加1.7倍,培养4天增加2.7倍(p<0.05)；同时DNA碱基切除修复系统被激活,主要的DNA修复酶PARP1活性随高浓度葡萄糖培养时间的延长逐渐增强,活性氧清除剂NAC与高浓度葡萄糖共培养HepG2细胞可抑制PARP1的活性。3) PARP1活化消耗了大量细胞内的NAD。与5.5mM葡萄糖相比,细胞内NAD含量下降了50%；同时PARP1的活化下调了细胞内NAD生成酶NMNAT1的蛋白水平。PARP1抑制剂PJ34对高糖培养条件下细胞内NAD含量消耗有显著的恢复作用,可将NAD水平从相当于对照组的50%恢复至75%(p<0.05)。4)PARP1活化在降低细胞内NAD水平的同时下调了细胞内NAD依赖蛋白SIRT1和AMPK的活性及蛋白水平。PJ34处理可以反转这两种蛋白的下降水平(p<0.05)。5) PARP1活化使细胞内胰岛素受体磷酸化水平显著下降(p<0.05),与PJ34共作用后,胰岛素受体磷酸化水平明显恢复(p<0.05),与5.5mM葡萄糖培养下的HepG2细胞内胰岛素受体磷酸化水平相比无显著性差异。6) PARP1活化可影响HepG2细胞的存活率,PJ34处理可以部分反转这种现象。结论：1)体外模拟长期的细胞外高浓度葡萄糖状态可诱发HepG2细胞内活性氧生成缓慢积累,同时损伤细胞内的DNA,并激活DNA修复酶PARP1;2)DNA修复酶PARP1活化通过消耗细胞内NAD以及下调细胞内NAD生成酶NMNAT1的蛋白水平降低了细胞内NAD的含量,下调了细胞内NAD依赖蛋白SIRT1和AMPK的活性及蛋白水平,并进一步导致胰岛素受体磷酸化水平的下降；3)PARP1抑制剂PJ34可逆转以上由于PARP1的活化所引起的细胞内系列现象,证实了体外高浓度葡萄糖培养状态下HepG2细胞内PARP1的活化参与了葡萄糖毒性过程及部分机理。4)本研究为探讨细胞自身反应与细胞功能调节之间的关系以及在疾病发展中的可能作用提供了新的实验依据。

全文目录

目录  3-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-17
  一、葡萄糖毒性的直接作用  9-11
  二、葡萄糖毒性的非直接作用  11-17
材料和方法  17-33
  一、材料  17-20
  二、主要试剂的配制  20-22
  三、实验方法  22-33
结果  33-59
  一、高糖状态下不同细胞内活性氧生成的改变  33-42
  二、高糖状态下HEPG2细胞DNA损伤与修复的改变  42-47
  三、PARP1活化对细胞内NAD水平的影响  47-50
  四、PARP1活化对NAD依赖蛋白的影响  50-53
  五、PARP1活化对胰岛素受体磷酸化水平的影响  53-57
  六、PARP1活化对HEPG2细胞存活的影响  57-59
结论  59-60
讨论  60-71
  一、高糖诱导氧化应激反应与DNA修复酶激活  60-63
  二、PARP1活化下调胰岛素受体磷酸化水平  63-67
  三、研究意义  67-69
  四、问题与展望  69-71
参考文献  71-79
缩略词表  79-82
综述  82-106
  一、氧化应激与糖尿病的发生、发展  82-88
  二、氧化应激和DNA损伤修复  88-91
  三、DNA损伤修复与糖尿病的发生、发展  91-99
  参考文献  99-106
致谢  106-107

多聚ADP核糖聚合酶1在HepG2肝细胞内葡萄糖毒性中的作用及机制研究

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