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黄粉虫β-1，3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化、部分生物学功能及其基因克隆

作　者: 张嵘
导　师: 吴春福；李福律
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药学
关键词: 黄粉虫 模式识别 β-1，3葡聚糖识别蛋白 亲和层析
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


虽然目前从脊椎动物及昆虫体内已经分离获得多种不同类型的模式识别蛋白，但对于模式识别的分子机制及模式识别蛋白识别病原体的结构基础了解甚少。了解无脊椎动物体内的酚氧化酶原激活系统的关键问题之一即是当宿主受到病原体侵害的时候，肽聚糖或β-1，3-葡聚糖结合蛋白等模式识别蛋白是如何启动酚氧化酶原激活系统的。为了了解β-1，3-葡聚糖识别蛋白在昆虫酚氧化酶原激活系统中的作用，本研究利用β-1，3-葡聚糖亲和填料，从黄粉虫幼虫血淋巴中分离纯化获得一种新的β-1，3-葡聚糖识别蛋白—Tm-βGRP。纯化后的Tm-βGRP只能与β-1，3-葡聚糖发生特异性结合而不能结合肽聚糖，该蛋白存在于黄粉虫的血浆中。生物学功能研究实验表明，内源性Tm-βGRP的含量会随着酚氧化酶原的激活而减少，而抗Tm-βGRP多克隆抗体对黄粉虫血淋巴酚氧化酶活性的抑制作用呈现一种剂量依赖性的趋势。如果在黄粉虫的血淋巴中加入外源性Tm-βGRP，β-1，3-葡聚糖依赖性酚氧化酶原的激活速度可明显加强。利用亲和层析柱分离血淋巴所获得的各个组分在体外重建β-1，3-葡聚糖依赖性的酚氧化酶原激活系统，实验结果表明，除Tm-βGRP外可能还存在其他未知蛋白质对于激活β-1，3-葡聚糖依赖性的酚氧化酶原同样是必需的。基因克隆结果表明，Tm-βGRP基因包括1443个核苷酸，可编码产生包含481个氨基酸残基的蛋白质，估计分子量为54034.2 Da的蛋白，预测等电点为7.545。氨基酸与核苷酸序列比对结果表明，Tm-βGRP与其他已知昆虫p-1，3-葡聚糖识别蛋白及部分革兰氏阴性菌识别蛋白具有较高的同源性。综上所述，本研究从黄粉虫体内发现一种新的能够与β-1，3-葡聚糖特异性结合并激活β-1，3-葡聚糖依赖性酚氧化酶原激活系统的蛋白质。首次发现β-1，3-葡聚糖识别蛋白在酚氧化酶原的激活过程中的含量不断减少。同时发现，除Tm-βGRP外β-1，3-葡聚糖依赖性酚氧化酶原激活系统的其他组成成分也可与葡聚糖亲和层析柱特异性结合。

全文目录


中文摘要  10-11
Abstract  11-13
中英文缩写词表  13-15
氨基酸缩写  15-16
第一章 绪论  16-42
  1.1 先天性免疫与获得性免疫的关系  16-18
  1.2 先天性免疫系统中模式识别作用的策略  18-23
  1.3 昆虫的先天性防御系统  23-40
  1.4 本研究的目的及其意义  40-42
第二章 黄粉虫酚氧化酶原激活系统的初步研究  42-52
  2.1 实验材料  43-44
  2.2 实验方法  44-45
  2.3 实验结果  45-49
    2.3.1 大肠杆菌注入实验  45-46
    2.3.2 不同类型PAMPs对黄粉虫酚氧化酶原的激活情况  46-48
    2.3.3 β-1,3-葡聚糖依赖性酚氧化酶原激活系统相关成分的基本分布  48-49
  2.4 讨论  49-51
  2.5 小结  51-52
第三章 黄粉虫体内β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化  52-72
  3.1 实验材料  52-54
  3.2 实验方法  54-60
  3.3 实验结果  60-67
    3.3.1 β-1,3-葡聚糖亲和层析填料的制备与鉴定  60-62
    3.3.2 53kDa蛋白质部分氨基酸序列的测定  62-64
    3.3.3 Tm-βGRP的分离纯化  64-66
    3.3.4 Tm-βGRP多克隆抗体的制备及滴度测定  66-67
  3.4 讨论  67-71
  3.5 小结  71-72
第四章 β-1,3-葡聚糖识别蛋白生物学功能的初步研究  72-88
  4.1 实验材料  73-74
  4.2 实验方法  74-76
  4.3 实验结果  76-84
    4.3.1 Tm-βGRP的组织定位  76
    4.3.2 Tm-βGRP单体的结合特异性  76-77
    4.3.3 Tm-βGRP在酚氧化酶原激活过程中的生物学特点  77-82
    4.3.4 亲和层析柱8mol·L~(-1)尿素组成成分生物学功能的初步研究  82-84
  4.4 讨论  84-86
  4.5 小结  86-88
第五章 β-1,3-葡聚糖识别蛋白的基因克隆与表达  88-115
  5.1 实验材料  88-92
  5.2 实验方法  92-102
  5.3 实验结果  102-113
    5.3.1 Tm-βGRP的cDNA克隆  102-106
    5.3.2 Tm-βGRP基因及蛋白质序列的分析  106-112
    5.3.3 Tm-βGRP基因在S2细胞中的表达  112-113
  5.4 讨论  113-114
  5.5 小结  114-115
结论  115-116
参考文献  116-129
致谢  129-130
发表文章  130

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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