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抑制宋内志贺菌益生菌株的筛选及作用机制研究

作　者: 张英春
导　师: 张兰威
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 乳酸杆菌宋内志贺菌抗菌性抑制黏附 S-层蛋白细胞屏障
分类号: R371
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

应用益生菌制剂防治致病菌感染,具有安全和减少耐药性等优点,为控制致病菌感染性疾病提供了新的途径。中国是一个乳酸菌资源十分丰富的国家,为乳酸菌的研究和开发利用提供了很好的平台。本论文采用了有效的筛选路线,筛选出对肠道致病(S. sonnei)有特异性抑制作用的益生菌菌株,并对其抑制S. sonnei的机制进行了探讨。以传统食品和粪便中分离的197株目标菌株为资源,以LGG为参考菌株,采用琼脂扩散法初步筛选出了53株对致病菌S. sonnei、E. coli和S. Typhimurium有不同的抑制作用的菌株,结果发现不同来源的菌株对致病菌的抑制性不同,其中23株乳酸菌对S. sonnei具有较强的抑制性。同时以HT-29细胞为模型,评价了53株初筛菌株的粘附特性,筛选出了具有粘附性的25株乳酸菌,即黏附指数大于50个细菌/100cells。结合这两个指标,共筛选出13株乳酸杆菌(M5-L、J10-L、J21-L、Q8-L、X12-L、Q6-L、G15-L、F0421、IN3432、IN3821、IN4025、IN4024、IN3623)作为初筛菌株,并研究了它们对模拟胃肠道环境的耐受性,结果发现不同来源的菌株对胃液的耐受性不同,采用Biolog微生物鉴定系统对初筛菌株进行了鉴定。通过对13株乳酸杆菌和LGG发酵18 h产生的抑菌化合物分析,发现乳酸杆菌的发酵上清液(CFCS)经过蛋白酶K处理、热处理后并不影响其抑菌活性,而将CFCS的pH调整为6.5后,其抑菌活性消失。初步判断乳酸杆菌产生的主要抑菌物质是有机酸类物质,而不是抗菌肽类物质。通过进一步研究乳酸杆菌的CFCS和CFCS-pH 6.5对S. sonnei的生长影响时发现,乳酸杆菌产生的有机酸对S. sonnei具有杀伤作用,2 h后S. sonnei的活菌数下降了2.7-3.9个log值,而3 h后,大多数乳酸杆菌的CFCS中检测不到S. sonnei的活菌数。而在CFCS-pH6.5培养过程中,S. sonnei的生长没有受到影响,与对照组的生长趋势接近一致,说明其它的抑菌物质没有发挥作用,进一步证明了乳酸杆菌产生的抑菌化合物主要是有机酸。通过HPLC分析有机酸发现,乳酸杆菌产生的乳酸含量在183-293 mmol/L之间。以HT-29细胞为模型,研究了13株乳酸杆菌对S. sonnei排除、竞争和取代黏附作用。从中有效筛选出4株具有显著抑制S. sonnei黏附作用的菌株M5-L、J10-L、Q8-L和F0421。其中的M5-L和F0421在三种作用方式中具有显著抑制S. sonnei的黏附作用。对M5-L、J10-L、Q8-L和F0421进行氯化锂、高碘酸钠和热处理后,进行抑制S. sonnei的黏附作用,发现经过氯化锂处理后,抑制黏附能力显著下降,确定乳酸杆菌中S-层蛋白与S. sonnei竞争黏附位点是其抑制S. sonnei黏附的主要作用机制。SDS-PAGE分析M5-L、J10-L、Q8-L和F0421中提取的S-层蛋白,证明了S-层蛋白的存在,其中M5-L、J10-L和Q8-L中的主要S-层蛋白分子量为45 kDa左右,而F0421的主要S-层蛋白分子量为40 kDa左右。通过对S-层蛋白中的氨基酸组成分析发现,其中含有大量的疏水性氨基酸,其含量分别为40.52%、43.80%、41.45%和35.40%。考虑到M5-L和F0421在排除、竞争和取代S. sonnei黏附作用的效果都比较显著,所以选择M5-L和F0421这2株菌做进一步实验。最后研究了F0421和M5-L对S. sonnei引起上皮细胞屏障功能破坏的防护作用。免疫组化结果显示,F0421能够阻止S. sonnei引起的ZO-1和occludin蛋白表达量的减少,而M5-L能够阻止S. sonnei引起的occludin蛋白表达量的减少,表明其对S. sonnei引起的上皮细胞屏障功能损伤具有防护作用。通过ELISA测定各个处理组细胞上清液中IL-8和IL-10的含量变化,表明乳酸杆菌F0421和M5-L主要是通过抑制S. sonnei刺激HT-29细胞产生IL-8来保护上皮细胞免于损伤的,而对于IL-10产生的影响不显著。经过16SrDNA进一步鉴定,M5-L为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei subsp paracasei),F0421为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-15
第1章绪论  15-36
  1.1 课题背景及研究目的和意义  15-16
  1.2 益生菌研究进展  16-20
    1.2.1 益生菌的定义  16
    1.2.2 体外筛选益生菌存在的问题  16-19
    1.2.3 体外筛选益生菌黏附肠上皮细胞模型  19-20
  1.3 引起慢性肠道疾病的有关致病菌  20-21
    1.3.1 引起肠道疾病的致病菌  20
    1.3.2 志贺菌的侵袭机制  20-21
  1.4 益生菌对肠道致病菌抑制作用的国内外研究现状  21-24
    1.4.1 益生菌对肠道致病菌抑制作用的体外研究  21-22
    1.4.2 益生菌对肠道致病菌抑制作用的体内和临床研究  22-24
  1.5 益生菌抑制致病菌的机制研究进展  24-35
    1.5.1 益生菌抑制肠道致病菌的生长繁殖  24-26
    1.5.2 益生菌与致病菌的竞争性粘附  26-30
    1.5.3 益生菌对致病菌引起肠上皮细胞屏障功能的调节作用  30-35
  1.6 本论文的主要研究内容及课题来源  35
  1.7 论文的创新点  35-36
第2章实验材料与方法  36-55
  2.1 实验材料与设备  36-41
    2.1.1 仪器与设备  36-37
    2.1.2 试剂与药品  37-39
    2.1.3 培养基  39-40
    2.1.4 指示菌株和细胞  40-41
    2.1.5 发酵食品与粪便来源  41
  2.2 抑制致病菌的乳酸菌株筛选  41-45
    2.2.1 样品中微生物的初步分析  41
    2.2.2 样品中乳酸菌的分离  41-42
    2.2.3 具有抑菌作用乳酸菌株的筛选  42
    2.2.4 具有粘附性乳酸菌株的筛选  42-43
    2.2.5 初筛菌株选择  43
    2.2.6 初筛菌株对模拟胃肠道环境的耐受性  43-44
    2.2.7 初筛菌株形态学特性及生化鉴定  44-45
  2.3 乳酸杆菌产生的抑菌化合物分析  45-46
    2.3.1 代谢产物中抑菌化合物的分析  45
    2.3.2 乳酸菌发酵上清液对S. sonnei 生长的影响作用  45
    2.3.3 乳酸杆菌上清液中乳酸和丁二酸含量测定  45-46
  2.4 乳酸杆菌抑制S. sonnei 的黏附的筛选及其相关机制研究  46-52
    2.4.1 乳酸杆菌排除S. sonnei 对HT-29 黏附作用  46-47
    2.4.2 乳酸杆菌与S. sonnei 对HT-29 细胞的竞争黏附作用  47
    2.4.3 乳酸杆菌对S. sonnei 黏附HT-29 细胞的取代作用  47
    2.4.4 乳酸杆菌与S. sonnei 的聚合能力研究  47-48
    2.4.5 乳酸杆菌抑制粘附分子的研究  48-49
    2.4.6 乳酸杆菌浓度对S. sonnei 的抑制粘附作用影响研究  49
    2.4.7 S-layer 蛋白对S. sonnei 的抑制粘附作用研究  49
    2.4.8 乳酸杆菌S-layer 蛋白性质的初步研究  49-51
    2.4.9 16SrDNA 鉴定两株乳杆菌  51-52
  2.5 乳酸杆菌对S. sonnei 损伤细胞屏障功能的防护作用研究  52-54
    2.5.1 细胞形态学观察  52-53
    2.5.2 免疫细胞化学检测ZO-1 和occludin 蛋白  53-54
    2.5.3 乳酸杆菌对S. sonnei 刺激细胞产生IL-8 和IL-10 的影响作用  54
  2.6 数据处理  54-55
第3章具有抑制肠道致病菌的乳酸杆菌初筛  55-71
  3.1 引言  55-56
  3.2 采集样品中乳酸菌的分离  56-58
  3.3 具有抑菌制作用的乳酸菌株  58-61
  3.4 初筛菌株的黏附性筛选  61-63
  3.5 初筛菌株的选择  63-64
  3.6 初筛菌株对模拟胃肠道环境的耐受性  64-66
  3.7 初筛菌株对模拟小肠液的耐受性  66-68
  3.8 初筛菌株形态特性  68
  3.9 Biolog 鉴定初筛菌株  68-70
  3.10 本章小结  70-71
第4章乳酸杆菌产生抑菌化合物的筛选分析  71-82
  4.1 引言  71
  4.2 乳酸杆菌代谢产物的性质研究  71-75
  4.3 乳酸杆菌发酵上清液对S. sonnei 生长的影响  75-78
  4.4 乳酸杆菌上清液中乳酸和丁二酸的含量  78-80
  4.5 本章小结  80-82
第5章乳酸杆菌抑制S. sonnei 的黏附筛选及其相关机制研究  82-104
  5.1 引言  82-83
  5.2 乳酸杆菌抑制S. sonnei 对HT-29 细胞的黏附作用筛选  83-87
    5.2.1 乳酸杆菌排除S. sonnei 对HT-29 黏附作用  83-84
    5.2.2 乳酸杆菌与S. sonnei 对HT-29 细胞的竞争黏附作用  84-85
    5.2.3 乳酸杆菌对S. sonnei 黏附HT-29 细胞的取代作用  85-87
  5.3 乳酸杆菌与S. sonnei 的聚合能力  87-89
  5.4 乳酸杆菌抑制粘附分子的确定  89-96
    5.4.1 5mol/L LiCl 处理  89-91
    5.4.2 高碘酸钠处理  91-93
    5.4.3 热处理  93-96
  5.5 乳酸杆菌浓度和S-layer 蛋白对抑制粘附的影响  96-98
  5.6 乳酸杆菌S-layer 蛋白的基本性质  98-101
    5.6.1 S-layer 蛋白分子量的测定  98-100
    5.6.2 S-layer 蛋白含量和氨基酸组成的测定  100-101
  5.7 16S rDNA 鉴定菌株  101-103
  5.8 本章小结  103-104
第6章乳酸杆菌对S. sonnei 引起细胞屏障功能损伤的防护作用  104-116
  6.1 引言  104-105
  6.2 不同干预组细胞形态的变化  105-106
  6.3 乳酸杆菌对S. sonnei 引起ZO-1 和occludin 蛋白表达的影响  106-111
    6.3.1 一抗浓度的选择  106-107
    6.3.2 ZO-1 蛋白表达的变化  107-109
    6.3.3 Occludin 蛋白表达的变化  109-111
  6.4 乳酸杆菌对S. sonnei 刺激细胞产生IL-8 的影响作用  111-113
  6.5 乳酸杆菌对S. sonnei 刺激细胞产生IL-10 的影响作用  113-115
  6.6 本章小结  115-116
结论  116-117
参考文献  117-139
附录一  139-142
附录二  142-144
攻读博士学位期间发表的论文及其它成果  144-146
致谢  146-147
个人简历  147

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