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海带线粒体及部分核基因组结构特征研究

作　者: 张静
导　师: 张志峰；刘涛
学　校: 中国海洋大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 海带线粒体基因组核基因组结构特征系统进化重复序列
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

海带是一种冷水性大型经济海藻,具有重要的经济价值,可作为食品、化工原料、保健产品、生物肥料等。另外,海带生物量巨大,是太平洋和大西洋暖温带海域潮下带的重要初级生产力,在近海生态系统中占据重要的生态地位。海带生活史中特征性的异型世代交替现象使之成为了藻类学和遗传学研究的典型生物。海带栽培在我国海水养殖业中占据极其重要的地位,我国海带养殖面积、养殖产量均居世界首位。与海带栽培业相比,海带分子水平的基础理论研究相对落后,海带基因组信息知之甚少,使海带研究缺乏较为全面的遗传背景信息,目前尚无法深入阐明海带的遗传机制与机理,也限制了多项工作的开展。鉴于此,开展海带基因组的研究显得迫在眉睫。本论文首次针对海带线粒体及核基因组的结构特征进行探讨,研究内容包括了两部分:一是利用逐段扩增的方式扩增并测定了“荣福”海带(Laminaria japonica×Laminaria saccharina)、长叶海带(Laminaria longissima)、极北海带(Laminaria hyperborean)的线粒体全序列,结合公共数据库中海带属线粒体DNA(mitochondrion DNA, mtDNA)数据,探讨海带属线粒体DNA结构特征,并首次在线粒体基因组水平上探讨海带属的分类地位及系统发育关系;二是首次利用高通量测序技术对“荣福”海带基因组进行随机测序,在此基础上分析重复序列在海带基因组中的组成和分布特征,为大规模高效开发具有多态性的微卫星等分子标记提供借鉴。主要研究结果如下:(一)线粒体基因组的结构特征及系统进化分析测定了“荣福”海带、长叶海带、极北海带3种海带的线粒体全序列,其序列长度分别为37,638 bp、37,628 bp、37,976 bp。编码66~67个基因(极北海带67个),其中38~39个蛋白编码基因(极北海带39个)、3个核糖体RNA基因(rRNA)、25个转运RNA基因(tRNA)。海带属线粒体基因组的基本结构特征:基因排列紧凑,基因间隔区较短,除掌状海带(Laminaria digitata)和极北海带有ORF 157基因的插入外,基因数目及排列方式完全一致,未发生基因重排现象;在碱基组成方面,海带属的mtDNA全序中A+T含量丰富,均占65%左右,且主编码链呈现G偏倚现象;在密码子使用上,海带属藻类均使用通用遗传密码,除了掌状海带和极北海带的ORF157基因以GTG为起始密码子,其它基因的起始密码子均为标准起始密码子ATG,终止密码子出现了TAA,TAG,TGA三种类型,且更偏向于使用TAA,同义密码子的使用与密码子第三位点的碱基组成密切相关。首次发现相对真海带(Laminaria japonica)线粒体基因组,“荣福”海带在rps3和rps9基因之间的非编码区缺失了19个碱基,进一步研究我国7个主要养殖品种和种群发现,根据这一非编码区的有无可将其划分为2个类群,“荣福”、“三海”、“福建”海带均存在这一非编码区的缺失,“爱伦湾”、“东方2号”、“东方3号”、“早厚成”海带则具备这一非编码区,因此该变异可以作为海带种质亲缘鉴定的依据。结合目前已获得的海带属线粒体基因组数据,分别利用30个蛋白编码基因联合序列及rRNA基因联合序列进行海带属系统发育树的重建,结果显示:海带属藻类聚为两支,掌状海带和极北海带聚为一支,另外一支包括狭叶海带(Laminaria angustata)、革质海带(Laminaria coriacea)、鬼海带(Laminaria diabolica)、真海带、长叶海带、长柄海带(Laminaria longipedalis)、利尻海带(Laminaria ochotensis)、皱海带(Laminaria religiosa)和“荣福”海带。其聚类结果与海带外部形态特征及地理分布相吻合。(二)核基因组的串联重复序列分析首次将新一代高通量测序技术(454 GS FLX Titanium)应用于海带基因组研究。对构建的基因组文库进行了随机测序,序列经拼接后得到了18,051条非冗余序列,序列总长为9,397,460 bp,约占海带基因组的1.33%。对海带核基因组的串联重复序列进行统计分析,发现的串联重复序列共计1782条,长度累计为100,320 bp,占测序总长的1.00%。其中微卫星序列770条,小卫星序列992条,卫星序列20条,分别占串联重复序列总数的43.21%,55.67%,1.13%。微卫星序列在海带基因组中的分布特征如下:平均每12 kb出现一个微卫星序列;重复单位长度与拷贝数呈中度负相关(γ=-0.719);微卫星序列各重复类型的丰度存在着规律性的分布特征:一、三、五由质数数目组成的重复类型其重复序列数目分别高于两侧重复类型为二、四、六偶数的重复序列数目;三碱基重复微卫星序列是海带基因组中的优势重复类型,重复序列数目占微卫星序列总数的32.21%,且三碱基重复是可以作为分子标记的微卫星序列中多态性最高的重复类型;海带基因组微卫星序列为富含AT的序列,A+T含量大于50%的共计有582条,占微卫星序列总数的75.58%。小卫星序列在海带基因组中的分布特征如下:平均每9 kb出现一个小卫星序列,其丰度较微卫星的高,且长度为26 bp的重复单位序列数量最多,占小卫星序列总数的9.07%;在小卫星序列中,随着重复单位长度的增加,其所对应的重复序列数目呈递减趋势;海带基因组小卫星序列重复单位拷贝数主要集中在低拷贝区(2~12个拷贝);海带基因组小卫星序列为富含AT的序列,其A+T含量大于50%的序列计有741条,占小卫星序列总数的74.70%。本研究所进行的mtDNA基因组全序列的结构特征及系统进化分析、海带核基因组重复序列组成与结构特征分析,为海带基因组学研究提供了最为直接的信息,同时也为海带的遗传学研究和实践应用奠定了良好的基础。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-14
0 前言  14-16
1 文献综述  16-39
  1.1 海带生物学特征概述  16-18
    1.1.1 海带分类与自然分布  16
    1.1.2 海带的外部形态  16-17
    1.1.3 海带的生活史  17-18
  1.2 藻类线粒体基因组概述  18-26
    1.2.1 线粒体的起源与进化  18-19
    1.2.2 藻类mtDNA 结构组成及特性  19-23
    1.2.3 藻类mtDNA 的研究进展  23-26
  1.3 藻类核基因组研究概述  26-39
    1.3.1 核基因组结构特征  26-33
    1.3.2 核基因组研究方法  33-36
    1.3.3 藻类核基因组研究进展  36-39
2 海带线粒体基因组结构特征  39-87
  2.1 材料与试剂  39-40
    2.1.1 实验材料  39
    2.1.2 试剂与仪器  39-40
  2.2 实验方法  40-46
    2.2.1 总DNA 提取  40-41
    2.2.2 PCR 引物的设计  41-42
    2.2.3 PCR 扩增  42
    2.2.4 琼脂糖凝胶电泳  42
    2.2.5 序列测定  42
    2.2.6 序列拼接及全序列结构分析  42-43
    2.2.7 系统发育分析  43-46
  2.3 结果与分析  46-80
    2.3.1 总DNA 提取结果  46
    2.3.2 “荣福”海带、长叶海带和极北海带mtDNA 的PCR 扩增结果  46-48
    2.3.3 测序结果与序列拼接  48-52
    2.3.4 碱基组成  52-53
    2.3.5 蛋白质编码基因  53-64
    2.3.6 tRNA 基因  64-68
    2.3.7 rRNA 基因  68-69
    2.3.8 “荣福”海带与真海带mtDNAs 比较分析结果  69-70
    2.3.9 系统进化分析结果  70-80
  2.4 讨论  80-85
    2.4.1 线粒体基因组全序列测定策略的选择  80-81
    2.4.2 海带属线粒体基因组比较基因组学的研究  81-83
    2.4.3 线粒体基因组序列在系统发育中的研究  83-85
  2.5 本章小结  85-87
3 海带核基因组结构特征  87-113
  3.1 材料与试剂  87-88
    3.1.1 实验材料  87
    3.1.2 试剂与仪器  87-88
  3.2 实验方法  88-91
    3.2.1 海带基因组含量的测定  88
    3.2.2 “荣福”海带全基因组DNA 提取  88
    3.2.3 Roche/454 文库构建、测序及拼接  88-89
    3.2.4 基因组结构特征分析  89-91
  3.3 结果与分析  91-105
    3.3.1 DNA 含量测定及测序结果统计  91-93
    3.3.2 海带基因组中串联重复序列分布特征  93-105
  3.4 讨论  105-110
    3.4.1 海带基因组微卫星序列  105-108
    3.4.2 海带基因组小卫星序列  108-110
  3.5 本章小结  110-113
参考文献  113-122
附录  122-133
致谢  133-134
个人简历  134
获得的奖励  134
发表的学术论文  134-135

海带线粒体及部分核基因组结构特征研究

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