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棉花黑斑病相关基因的克隆及其早期诊断的探究

作　者: 黄华坤
导　师: 吴沿友
学　校: 江苏大学
专　业: 农业生物环境与能源工程
关键词: 棉花轮纹菌棉花多聚半乳糖醛酸酶基因多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因半定量反转录聚合酶链式反应叶绿素荧光
分类号: S435.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 48次
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内容摘要

棉花轮纹菌(Alternaria macrospora)是棉花黑斑病的病原体,该病多发于苗期,在棉叶上产生黑斑,致使其脱落。病原体分泌的多聚半乳糖醛酸酶能够降解组成植物细胞壁的果胶多糖,打开抵御入侵的第一道屏障,因此在侵染植物初期起着重要的作用。植物的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白在植物的抵抗疾病机制中作用显著,能够高效、专一的结合病源体侵染时分泌的多聚半乳糖醛酸酶,抑制其活性。因此,对编码这两种生物大分子的基因研究有利于揭示植物抵抗真菌机制。此外,对于棉花黑斑病的早期检测方面目前尚无报道。本文克隆了棉花轮纹菌多聚半乳糖醛酸酶基因(ampg)以及棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ghpgip1),并以Ghpgip1基因为“探针”,在棉花黑斑病早期诊断领域做了探索性研究,并以叶绿素荧光技术辅助、对比这一探究。研究取得了下列几方面的主要结果和结论:利用引物设计技巧设计一对引物,克隆了棉花轮纹菌的一个编码多聚半乳糖醛酸酶基因,开放阅读框大小为1242bp,命名为ampg。序列比对结果表明它的核甘酸序列与同属中的另外两真菌Alternaria alternata和Alternaria citri的同源性非常高(分别为98.4%和98.3%),而它们编码的蛋白质序列同源性却只有76%,且ampg没有内含子。蛋白质序列分析结果显示ampg编码的蛋白AMPG比上面两种真菌对应蛋白多出27个左右氨基酸残基,并且有一段位于酶的活性位点(H-x-x-S-x-x-S)处,使其结构更松散,可能导致酶的活性降低。这一结论为Alternaria真菌家族进化研究提供参考依据。对AMPG二级结构预测结果显示:它属于糖基水解酶28家族,拥有两个多聚半乳糖醛酸酶特有的PbH1域,一个预测的N-糖基化位点,五个预测的O-糖基化位点。克隆了棉花(Gossypium hirsutum)的一段长993bp pgop基因,命名为Ghpgip1,能够编码一段长330氨基酸残基,分子量与等电点分别为37.0 KDa与8.30的蛋白质。Ghpgip1核酸序列与其他9种物种的同源性为65.6%到70.3%,对应的蛋白质序列为63.4%到68.6%。其编码的蛋白GhPGIP1有10个N端、C端半胱氨酸残基,6个可能的N糖基化位点和5个保守的亮氨酸重复结构域(LRR)。在所有的保守LRR域中,L是高度保守的。半定量RT-PCR试验结果显示Ghpgip1在棉花的根、茎、叶中均表达,其中以叶中表达量最多,根和茎中相似。棉花黑斑病是棉花苗期危害最深的三大病害之一,关于它的早期诊断目前国内外还没有见过报道,本文利用基于棉花“防御基因”——多聚半乳糖醛酸抑制蛋白基因表达的半定量反转录聚合酶链式反应,进行了棉花黑斑病早期诊断的探究,并用Sigmascan Pro专业图像处理软件将所得的图像信息转化为更客观、更有说服力的数字信息。结果显示:棉花感染黑斑病后1-5天内,该“防御基因”表达虽略有波动,但变化不显著,第5天为一个转折点,之后它的表达量急剧下降。用叶绿素荧光仪检测感染株与健康株,也得到相类似的结果。叶绿素荧光数据显示:光合作用系统PSⅡ反应中心的能量捕捉效率(FV/Fm)以及光合作用电子传递速率(ETR)总体上呈下降趋势,同样也是以5天为转折点,之前波动很小,之后两参数均急剧下降。因此,黑斑病菌入侵棉花时,后者对其有一短暂的防御阶段(5天左右),之后便开始感染上此病。这为棉花黑斑病施药的时机提供了参考,对该病的防治意义很大。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章棉花黑斑病及其两个重要基因的研究进展  11-24
  1.1 棉花黑斑病介绍  11-13
    1.1.1 棉花病害的分布及发生情况  11-12
    1.1.2 棉花黑斑病发生及研究现状  12-13
  1.2 病原体真菌入侵植物的机制  13-16
  1.3 PGs简介及研究进展  16-20
    1.3.1 PGs的分类与分布情况  16-17
    1.3.2 PGs的生物化学与物理化学性质  17-19
    1.3.3 植物分泌的PGs研究  19
    1.3.4 编码PGs的基因研究  19-20
  1.4 PGIPs简介及研究进展  20-21
  1.5 PGIPs-PGs作用机制  21-22
  1.6 本研究的目的意义和内容  22-24
    1.6.1 研究的背景、意义  22-23
    1.6.2 主要研究内容  23-24
第二章棉花黑斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析  24-40
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 棉花黑斑病菌  24
    2.1.2 主要试剂  24-25
    2.1.3 主要实验仪器  25
  2.2 实验方法  25-32
    2.2.1 棉花轮纹菌的制备  25
    2.2.2 RNA的制备  25-26
    2.2.3 DNA的制备  26-27
    2.2.4 基因组基因克隆  27-30
    2.2.5 cDNA克隆  30-31
    2.2.6 生物信息学分析  31-32
  2.3 结果与分析  32-38
    2.3.1 棉花黑斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因的基因组克隆结果  32-33
    2.3.2 棉花黑斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(ampg)RT-PCR结果  33
    2.3.3 重组克隆的PCR鉴定  33-34
    2.3.4 ampg基因cDNA片断的序列分析  34-35
    2.3.5 ampg编码的蛋白质氨基酸同源性比较  35-38
    2.3.6 多聚半乳糖醛酸酶分子进化分析  38
  2.4 讨论  38-40
第三章棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因克隆、序列及表达谱分析  40-49
  3.1 实验材料  41
    3.1.1 棉花种子  41
    3.1.2 主要试剂  41
    3.1.3 主要仪器  41
  3.2 实验方法  41-45
    3.2.1 棉花的培养  41-42
    3.2.2 棉花总RNA的提取  42
    3.2.3 cDNA克隆  42-43
    3.2.4 半定量RT-PCR对棉花多聚半乳糖醛酸酶基因表达谱分析  43-44
    3.2.5 序列的生物信息学分析  44-45
  3.3 结果与分析  45-47
    3.3.1 Ghpgip1 cDNA的开放阅读框序列  45-46
    3.3.2 Ghpgip1编码的蛋白质序列分析  46
    3.3.3 进化树分析  46-47
    3.3.4 表达谱分析  47
  3.4 讨论  47-49
第四章基于Chpgip1基因的棉花黑斑病早期诊断的探究  49-60
  4.1 试验材料  50-51
    4.1.1 被感染及健康的植物材料  50
    4.1.2 主要试剂  50-51
    4.1.3 主要仪器  51
  4.2 试验方法  51-53
    4.2.1 棉花轮纹菌的培养  51
    4.2.2 棉花的培养  51
    4.2.3 真菌感染棉花试验  51
    4.2.4 被感染及对照组棉花总RNA的提取  51
    4.2.5 半定量RT-PCR对感染棉花多聚半乳糖醛酸酶基因表达分析  51-52
    4.2.6 应用SigmaScan Pro软件对Sq RT-PCR电泳结果分析  52
    4.2.7 用叶绿素荧光仪对感染株进行检测  52-53
  4.3 结果与分析  53-58
    4.3.1 利用Sq RT-PCR对感染株与健康株Ghpgip1基因表达检测  53
    4.3.2 数码相机跟踪拍摄对感染株进行表形检测  53-54
    4.3.3 感染株Ghpgip1基因表达变化分析  54-55
    4.3.4 叶绿素荧光参数—时间曲线  55-57
    4.3.5 健康株与感染株叶绿素荧光图片  57-58
  4.4 讨论  58-60
第五章结论与展望  60-63
  5.1 结论  60-61
  5.2 展望  61-63
参考文献  63-72
致谢  72-73
攻读硕士期间发表的主要论文  73

棉花黑斑病相关基因的克隆及其早期诊断的探究

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