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大菱鲆hepcidin基因在巴氏毕赤酵母中的表达研究

作　者: 肖健康
导　师: 曾宪垠；陈松林
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 抗菌肽hepcidin 巴氏毕赤酵母 胞内表达
分类号: S963.73
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


大菱鲆是从欧洲引进的一种名贵经济鱼类，又称“多宝鱼”，营养丰富、味道鲜美、经济价值高，其养殖在我国已初步形成产业化，养殖前景看好。但目前大菱鲆鱼病的防治主要是大量使用抗生素和一些重金属化合物（如孔雀石绿等），造成鱼类耐药性增强、药物残留及重金属残留严重超标，使大菱鲆养殖业受到严重影响。因此，寻找新的抗生物质代替化学合成抗生素和重金属化合物的研究迫在眉睫。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子物质，是生物体天然免疫反应系统的重要成员，在生物体抵抗外界病原物感染过程中起着非常重要的作用。抗菌肽分布十分广泛，并且对真菌、大多数革兰氏阴性或阳性菌、原生动物都有抑制作用，有些抗菌肽还具有抗寄生虫、病毒和肿瘤的作用。本论文利用DNA重组技术，将大菱鲆抗菌肽hepcidin成熟肽片段的DNA序列插入pGAPZB表达载体，重组表达载体pGAPZB-TH电转化入巴氏毕赤酵母菌株X-33，通过对阳性转化子的表达情况进行分析，为开发转抗菌肽酵母作为鱼类饵料添加剂的应用提供理论基础。主要内容及结论如下：1．胞内表达载体的构建：提取大菱鲆肝脏总RNA并反转录成cDNA，根据大菱鲆hepcidin基因序列设计引物提取抗菌肽hepcidin基因成熟肽片段的DNA序列，并在目的片段后面加入凝血酶蛋白酶切位点。PCR得到的目的片段插入巴斯德毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中，构建了重组胞内表达载体pGAPZB-TH。2．表达载体的电转化及转化子的筛选：用BlnI单酶切重组表达载体后，用5～10ug的线性化质粒与山梨醇法制备的巴氏毕赤酵母X-33感受态细胞混匀冰浴后，在电转仪上以电压1.5KV、电容25uF、电阻200Q、电激4～5ms，转化入X-33。经过ZeocinTM抗性筛选和蜗牛酶法得到的转化子基因组PCR扩增筛选，分别得到了3株阳性转化子酵母菌株和3株阴性对照菌株。3．转化子Tricine SDS-PAGE及Western-blotting鉴定：转化子菌株及酵母X-33菌株经过YPD培养基在30℃，250 r／min培养后用蜗牛酶法提取胞内蛋白，TricineSDS-PAGE电泳显示阳性菌株在5.8kDa处有蛋白条带出现，而阴性对照菌株和酵母X-33菌株在相应位置则没有条带出现。Western-blotting分析表达的融合蛋白能与特异抗体anti-6his特异性结合，表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。4．阳性转化子时间表达动态：转化子菌株在培养过程中，按照时间点0、12、24、48、72、96、120 h分别取培养基10mL，在600nm下测定OD值，后破壁菌体提取蛋白进行Tricine SDS-PAGE。阳性转化子时间表达结果显示：在0～48 h没有检测到外源蛋白的表达，在72 h时，酵母胞内有微量的蛋白出现，在96 h时表达量最大。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-11
第一部分 前言  11-20
  1 抗菌肽的特点  11
  2 抗菌肽的作用机理  11-13
  3 Hepcidin抗菌肽的分子生物学及其功能  13-17
  4 抗菌肽的应用前景  17-20
第二部分 材料和方法  20-39
  1.材料  20-26
    1.1 供试鱼及其组织样品的采集  20
    1.2 主要试剂  20
    1.3 菌株及表达载体  20-21
    1.4 主要仪器设备  21-22
    1.5 贮存液和培养基  22-26
      1.5.1 琼脂胶电泳用贮存液:  22
      1.5.2 质粒抽提用缓冲液  22-23
      1.5.3 Tricine SDS-PAGE用贮存液  23-24
      1.5.4 Western-blotting用缓冲液  24-25
      1.5.5 培养基  25-26
  2.方法  26-39
    2.1 试验技术路线图  26
    2.2 肝脏总RNA的提取  26-27
    2.3 模板cDNA的获得  27
    2.4 引物的设计  27-28
    2.5 目的片段的扩增和纯化  28-29
    2.6 目的片段与pMD-18T连接转化  29-30
    2.7 载体pMD18-TH和pGAPZB的制备  30-31
    2.8 质粒的双酶切连接及转化子的筛选  31-32
    2.9 表达载体的转化  32-33
    2.10 转化子的鉴定  33-34
    2.11 阳性重组转化子整合、筛选及表达  34-35
    2.12 阳性转化子的鉴定  35-38
      2.12.1 Tricine SDS-PAGE  35-36
      2.12.2 Western-blotting  36-38
    2.13 转化子时间表达动态及菌株表达对菌株密度的影响  38-39
第三部分 结果与分析  39-47
  1 大菱鲆肝脏总RNA的检测  39
  2 引物的设计  39-40
  3 目的片段的电泳检验  40
  4 pMD18-TH所含目的片段的测序结果  40-41
  5 pGAPZB,pMD18-TH双酶切结果  41
  6 pGAPZB,pMD18-TH双酶切后回收结果  41-42
  7 载体pGAPZB-TH目的片段测序结果  42
  8 载体单酶切结果  42-43
  9 pGAPZBZ与pGAPZB-TH酵母转化子基因组  43
  10 pGAPZBZ与pGAPZB-TH酵母转化子PCR鉴定  43-44
  11 表达产物的Tricine SDS-PAGE分析  44
  12 融合蛋白的Western-blotting分析  44-45
  13 阳性转化子的时间表达动态  45-46
  14 菌株表达对菌株密度的影响  46-47
第四部分 讨论  47-54
  1 高质量总RNA的获得  47-48
  2 酵母菌株的选择  48-49
  3 表达载体及其酶切位点的选择  49-50
  4 电转化  50-51
  5 酵母转化子的PCR筛选  51
  6 多拷贝的筛选  51-52
  7 菌株表达条件的优化  52-54
第五部分 结论  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-61
攻读学位期间发表的学术论文目录  61

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 水产动物饵料及其营养 > 配合饲料 > 饵料添加剂
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