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三七凝胶对硬膜外瘢痕粘连的病理形态及相关细胞因子影响的实验研究

作　者: 王荣国
导　师: 周卫
学　校: 中国中医科学院
专　业: 中西医结合临床
关键词: 三七凝胶硬膜外瘢痕粘连胶原纤维环氧化酶-2(COX-2) 转化生长因子-β1（TGF-β1）金属蛋白激酶组织抑制剂-1(TIMP-1) 基质金属蛋白酶-1(MMP-1)
分类号: R26
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

研究背景脊柱外科术后造成的椎板缺损区是通过纤维结缔组织增生来修复，整个过程经历了早期的炎症反应、肉芽组织增生、纤维化、瘢痕组织形成及重塑等基本病理生理过程，其基础是早期炎性细胞的病理生理活动。早期的病理反应对瘢痕的形成有重要作用。硬膜外瘢痕组织增生与硬膜囊瘢痕粘连的形成是引起术后神经根刺激症状缠绵难愈的重要原因之一，严重影响脊柱外科手术的治疗效果和患者的生活质量。国内外学者在基础和临床研究中进行了大量关于硬膜外瘢痕粘连形成原因、预防材料及方法研究，取得了一定的进展，但仍存在防止粘连不完全、降解过快、生物相容性差等问题，有肯定效果、广泛应用于临床的材料和方法并没有。前期实验研究初步证实半流态的由活血止血特性的中药三七和卡波姆凝胶共同组成的三七凝胶在局部植入，不但起到三维立体的物理+化学遮挡作用预防硬膜外瘢痕粘连的形成，而且由于凝胶的特殊性状，使三七在局部缓慢释放，持续发挥药效，减少瘢痕组织的形成，软化瘢痕等作用。本实验旨在通过对三七凝胶预防椎板减压术后大鼠硬膜外瘢痕粘连的作用及相关机制的探讨，从现代医学的角度为中医药预防硬膜外瘢痕粘连提供更为科学的理论和实验依据。1实验一三七凝胶预防大鼠硬膜外瘢痕粘连的病理形态观察1．1实验目的观察三七凝胶对大鼠硬膜外瘢痕粘连的病理形态改变和胶原纤维增生情况。1．2实验方法1．2．1分组、造模干预72只（?）SD大鼠，平均体重380±20g，随机分为生理盐水组、凝胶组、粘连平组、三七凝胶组，每组18只大鼠；制作L3椎板切除模型，暴露硬膜囊；根据分组情况在硬膜外椎板缺损区分别给予如下处理：生理盐水、1％凝胶、粘连平、三七凝胶；各组按照实验设计要求分别在术后7天、14天、21天取材，各组每时间点取6只大鼠。1．2．2标本处理按照常规要求制作标本、切片，行HE染色和经典Masson染色。1．2．3观察项目及分析①常规观察椎板缺损区硬膜外组织的病理形态改变；②计算机自动图像分析绿染的胶原纤维的面密度百分比（目标面积／统计场面积×100％）；③硬膜外粘连程度He-Revel评分。1．3实验结果1．3．1病理形态观察7天：各组硬膜外被大量炎性肉芽组织充填，肉芽组织中以纤维母细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞为主。生理盐水组与凝胶组炎症反应程度相似，三七凝胶组和粘连平组的炎症反应比较轻，此外生理盐水组和凝胶组中有未被完全吸收的血肿，三七凝胶组中没有。14天：各组硬膜外肉芽组织中部分纤维母细胞与纤维细胞共存，肉芽组织开始胶原化，生理盐水组、凝胶组和粘连平组中的胶原排列混乱，与硬膜囊紧密粘连；三七凝胶组中的胶原排列趋于规则，硬膜囊较光滑，轻度粘连。21天：各组硬膜外可见疏松瘢痕形成，纤维母细胞被纤维细胞替代，纤维化组织中富含毛细血管网，胶原纤维逐渐成熟。生理盐水组、凝胶组和粘连平组中的胶原纤维变粗，排列杂乱，不规则，硬膜囊与瘢痕组织紧密粘连；三七凝胶组胶原纤维稀疏，排列规则，硬膜比较光滑，轻微粘连。1．3．2胶原纤维面密度7天时各组胶原纤维尚未形成，绿染的胶原纤维很少，轮廓模糊。14天时胶原纤维已经形成，但尚未完全成熟；三七凝胶组的胶原纤维面密度明显较生理盐水组和凝胶组低（P＜0.01），粘连平组较凝胶组少（P＜0.05）。21天时胶原纤维均已经成熟，胶原纤维较14天时间明显增粗，三七凝胶组硬膜外胶原纤维面密度较其他三组均少（P＜0.01或P＜0.05），粘连平组较凝胶组少（P＜0.05）。1．3．3硬膜外粘连程度14天时生理盐水组较其他三组硬膜外均粘连严重（P＜0.01或P＜0.05）；凝胶组、粘连平组和三七凝胶组间无显著差异（P＞0.05），但三七凝胶组硬膜外粘连程度有较凝胶组和粘连平组有减轻的趋势。21天时其他三组均较三七凝胶组硬膜外粘连严重（P＜0.01或P＜0.05），凝胶组较粘连平组粘连严重（P＜0.05）。2实验二三七凝胶对大鼠硬膜外瘢痕粘连相关细胞因子影响的研究2．1实验目的观察三七凝胶对大鼠硬膜外瘢痕粘连组织中COX-2、TGF-β₁、TIMP-1和MMP-1表达的影响，研究三七凝胶在控制硬膜外组织炎症反应，调节细胞增殖和胶原代谢等方面的作用，初步探讨三七凝胶预防大鼠硬膜外瘢痕粘连的相关机制。2．2实验方法2．2．1实验动物模型制备、分组、干预措施、取材、切片同实验一。2．2．2检测项目及分析免疫组化S-P法检测标本组织中的COX-2、TGF-β₁、TIMP-1和MMP-1，应用计算机自动图像分析系统进行定量分析，对COX-2、TGF-β₁、TIMP-1和MMP-1的阳性表达细胞进行计数和MOD值（平均光密度值）测定。2．3实验结果2．3．1各组术后7天、14天硬膜外COX-2的表达2．3．1．1 COX-2阳性表达部位主要表达于肉芽组织中的成纤维细胞、血管内皮细胞、单核巨噬细胞和部分肌细胞胞浆中。术后7天时表达最多，到术后21天时COX-2表达基本消失。2．3．1．2 COX-2的MOD值①7天时生理盐水组、凝胶组COX-2的MOD值显著高于三七凝胶组（P＜0.05）和粘连平组（P＜0.05），三七凝胶组与粘连平组无显著差异（P＞0.05）；简单表示为：生理盐水组、凝胶组＞三七凝胶组、粘连平组。②14天时生理盐水组、凝胶组和粘连平组COX-2的MOD值显著高于三七凝胶组（P＜0.05），粘连平组的MOD值低于生理盐水组和凝胶组（P＜0.05），但高于三七凝胶组（P＜0.05）；简单表示为：生理盐水组、凝胶组＞粘连平组＞三七凝胶组。2．3．1．3 COX-2阳性细胞计数其变化趋势与MOD值的变化趋势基本一致。2．3．2各组术后7天、14天、21天硬膜外TGF-β₁的表达2．3．2．1 TGF-β₁阳性表达部位早期主要表达于成纤维细胞和血管内皮细胞胞浆中，在吞噬细胞中也有表达，到术后21天时TGF-β₁的表达主要围绕胶原纤维分布。2．3．2．2 TGF-β₁的MOD值术后7天、14天和21天三个时间点中生理盐水组、凝胶组和粘连平组TGF-β₁的MOD值均显著高于三七凝胶组（P＜0.05），其他三组间比较无显著差异（P＞0.05）。各组均以术后7d时TGF-β₁的表达最高，TGF-β₁的表达随时间的推迟而逐渐减弱，到21d时TGF-β₁的表达明显减弱。2．3．2．3 TGF-β₁的阳性细胞计数其变化趋势与MOD值的变化趋势基本一致，但在术后7天三七凝胶组中TGF-β₁的阳性细胞数与其他三组比较无显著性差异（P＞0.05）。2．3．3各组术后7天、14天、21天硬膜外TIMP-1的表达2．3．3．1 TIMP-1阳性表达部位TIMP-1早期主要表达于成纤维细胞和血管内皮细胞胞浆中，在炎性细胞中表达较少；术后14天、21天时TIMP-1的表达主要围绕胶原纤维，呈梭形分布。2．3．3．2 TIMP-1的MOD值术后7天各组有TIMP-1的表达，各组间MOD值比较差异不显著（P＞0.05）；14天和21天时TIMP-1的表达逐渐增强（MOD值增高），三七凝胶组TIMP-1的表达强度（MOD值）较其他三组均弱（P＜0.05），凝胶组最强（P＜0.05），简单表示为：三七凝胶组＜生理盐水组、粘连平组＜凝胶组。2．3．3．3 TIMP-1的阳性细胞计数其变化趋势与MOD值的变化趋势基本一致，但是各组中TIMP-1的阳性细胞数随时间的延长有逐渐减少的趋势。2．3．4各组术后7天、14天、21天硬膜外MMP-1的表达2．3．4．1 MMP-1阳性表达部位MMP-1的阳性表达部位与TIMP-1的表达部位基本一致。2．3．4．2 MMP-1的MOD值术后7天、14天各组MMP-1的MOD值无显著差异（P＞0.05），但三七凝胶组在14天时MOD值有增高的趋势；术后21天三七凝胶组较其他三组MMP-1的MOD值均高（P＜0.05）。2．3．4．3 MMP-1的阳性细胞计数其变化趋势与MOD值的变化趋势基本一致，但是各组中MMP-1的阳性细胞数随时间的延长逐渐减少。3结论3．1三七凝胶是由止血活血中药三七浓缩液和卡波姆凝胶共同组成的凝胶制剂，生物相容性好，对动物无刺激作用。3．2三七凝胶可以有效抑制大鼠硬膜外瘢痕的形成及与硬膜囊的粘连，三七是其有效成分。单纯凝胶对硬膜外纤维性瘢痕的形成及与硬膜囊的粘连并没有影响。3．3三七凝胶通过抑制大鼠椎板缺损区局部COX-2的表达可以明显减轻椎板减压术对大鼠伤口组织局部的炎症反应；同时三七凝胶能减少早期硬膜外血肿。3．4三七凝胶在术后肉芽增生期没有破坏MMP-1／TIMP-1的动态平衡，不会延缓伤口的早期愈合。3．5三七凝胶在术后组织修复期可能通过抑制硬膜外组织中TGF-β₁的表达减少硬膜外胶原纤维的大量增生；同时抑制TIMP-1的表达，减少TIMP-1对MMP-1活性的抑制；也有可能是三七凝胶本身刺激了MMP-1的表达，增强MMP-1降解细胞外基质中过度沉积的胶原，使胶原纤维稀疏，减少瘢痕的形成。3．6三七凝胶组椎板减压术后大鼠硬膜外胶原纤维的排列趋于规则化，可能与组织中TGF-β₁的表达受到抑制有关，具体机制有待进一步研究。

全文目录

摘要  6-11
ABSTRACT  11-17
主要英文缩略语表  17-18
综述  18-30
前言  30-31
实验一三七凝胶预防大鼠硬膜外瘢痕粘连的病理形态观察  31-43
  1 实验目的  31
  2 材料与方法  31-35
    2.1 实验条件  31-32
    2.2 主要仪器  32
    2.3 主要试剂  32-33
    2.4 实验方法  33-35
  3 实验结果  35-43
    3.1 病理形态观察结果  35-37
    3.2 Masson染色结果  37-43
实验二三七凝胶对大鼠硬膜外瘢痕粘连相关细胞因子影响的研究  43-60
  1 实验目的  43
  2 材料与方法  43-46
    2.1 实验条件  43
    2.2 主要仪器  43
    2.3 主要试剂  43-44
    2.4实验方法  44-46
  3 结果  46-60
    3.1 各组术后7天、14天硬膜外表达COX-2的比较  46-49
    3.2 各组术后7天、14天、21天硬膜外表达TGF-β_1的比较  49-52
    3.3 各组术后7天、14天、21天硬膜外表达TIMP-1的比较  52-56
    3.4 各组术后7天、14天、21天硬膜外表达MMP-1的比较  56-60
讨论  60-74
  1 硬膜外瘢痕粘连研究概况  60-61
  2 中医药对硬膜外瘢痕粘连形成的认识及预防研究  61-62
  3 现代医学对硬膜外瘢痕粘连形成的认识  62-63
  4 凝胶和三七预防瘢痕粘连的实验基础  63-66
    4.1 卡波姆凝胶的特性  63-64
    4.2 三七的药物特性  64-65
    4.3 三七防止瘢痕形成的实验研究  65-66
  5 凝胶、粘连平、三七凝胶早期预防硬膜外瘢痕粘连有效性的讨论  66-67
  6 三七凝胶预防硬膜外瘢痕粘连形成初期的机制探讨  67-74
    6.1 三七凝胶对硬膜外组织中COX-2表达的影响  67-68
    6.2 三七凝胶在硬膜外组织中对TGF-β_1表达的影响  68-70
    6.3 三七凝胶在硬膜外组织中对MMP-1、TIMP-1表达的影响  70-74
结论  74-75
参考文献  75-78
致谢  78-79
附图  79-88

三七凝胶对硬膜外瘢痕粘连的病理形态及相关细胞因子影响的实验研究

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