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猕猴桃果实特异表达ipt基因的构建与转化体系建立的研究

作　者: 王静毅
导　师: 朱道圩
学　校: 河南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 猕猴桃 Actinidin-ipt嵌合基因实生苗组织培养体系
分类号: S663.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

猕猴桃是原产我国的野生藤本果树，属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)植物，是当前世界新兴果树之一。由于其风味独特，维生素C含量高，而倍受人们喜爱。然而猕猴桃种类繁多，某些种类的果实品质仍有需要改进之处。本研究的目的旨在利用基因重组技术构建猕猴桃果实特异表达ipt基因，以便利用转基因技术改进猕猴桃果实性状。 ipt为细胞分裂素生物合成关键酶。细胞分裂素对植物的生理功能和作用是多方面的，它能诱导和促进细胞分裂，诱导营养物质定向向细胞分裂素所在部位运输，还可以诱导组织分化，促进果实生长。在生产实践中，施用苯基脲类细胞分裂素(cppu)可诱导果树单性结实，提高座果率，增加糖酸比，以及增大果个等。在遗传转化方面，迄今为止，ipt基因已用于水稻、烟草、棉花、番茄等植物的转基因研究。然而，在猕猴桃转基因研究中尚无类似报告。关于ipt基因在猕猴桃果实中特异表达问题，已分离出猕猴桃素基因启动子作为果实特异表达ipt基因的启动子，可以保证ipt基因在猕猴桃果实中特异表达。猕猴桃素(Actinidin)是一种半胱氨酸蛋白酶，只在猕猴桃果实中呈现。为此，本研究用pRA-9质粒(含有Actinidin基因启动子)为出发质粒，构建猕猴桃果实特异表达Actinidin-ipt嵌合基因。另外，组织培养是实施基因工程的重要前提，基因工程以组织培养及植株再生系统为基础。许多研究表明，实生苗作为起始材料诱导愈伤组织对植株再生效应较好。而且，从遗传学角度讲，一株实生苗，一种基因型，有利于扩大基因型研究范围，对于植株再生体系建立有一定帮助。因此开展猕猴桃实生苗组织培养体系建立的研究很有必要。为此，本试验还以猕猴桃种子为起始材料，研究种子的赤霉素处理、消毒方法以及在不加激素情况下六种不同培养基对称猴桃组培实生苗生长状况的影响，初步建立经济高效的实生苗培养体系，为称猴桃果实特异表达Actinidin一iPt嵌合基因转化工作奠定材料基础。主要试验结果如下: 1.用pRA一9质粒(含有Actinidin基因启动子，1 .3kb)和pUCllg质粒(含有iPt编码基因0.7kb，Nostero.3kb)为出发质粒，通过质粒DNA提取与酶切、酶切产物的纯化与回收、载体与片段的连接等步骤在克隆载体puC 119质粒中构建称猴桃果实特异表达Actinidin一iPt嵌合基因，含有该嵌合基因的质粒被称作puC 1 19一Actinidin一iPt。PcR检测结果表明转化质粒pUC 1 19一Actinidin一iPt扩增出1 .3kb明亮片段，而原PUc 119质粒PCR对照未扩增出1 .3kb条带，说明称猴桃素启动子己经插入到pUCllg质粒中;酶切结果表明，转化质粒pUC 1 19一Act而din一iPt经Xbal与EcoRI酶切后切出约2.3kb的片段，说明称猴桃素基因启动子1.3kb已经插入载体，并被成功的与1.okb的iPt基因一同切出，而对照pUC 119经Xbal与EcoRI酶切后切出约1.6kb的片段，说明对照里不含有1.3kb的称猴桃素基因启动子，这就充分证实称猴桃果实特异表达Actinidin一iPt嵌合基因己经构建成功。 2.用pRA.9质粒(含有Actinidin基因启动子，1 .3kb)、pGEM一TEASY质粒(含有iPt编码基因0.72kb，)和pBn21为出发质粒，通过质粒DNA提取与酶切、载体与片段的连接等步骤在植物表达载体pBllZI质粒中构建称猴桃果实特异表达Actinidin一iPt嵌合基因，含有该嵌合基因的质粒被称作pBI 121-Actinidin一iPt。PCR检测结果表明转化质粒pBI 121一Actinidin一iPt可以扩增出1 .3kb明亮的目的片断，分别用Xbal与BamHI和Ba]卫Hl与Sacl双酶切转化质粒，电泳结果显示转化质粒被成功的切出了1 .3kb的称猴桃素启动子和0.72kb的iPt基因，说明植物表达载体pBI 121一Actinidin一iPt己被成功构建。 3.以饱满完熟的美味称猴桃种子为起始材料，初步建立了称猴桃实生苗组织培养体系。重点研究了附加不同浓度蔗糖的六种MS培养基对称猴桃组培实生苗生长状况的影响。六种MS培养基为:(l)Ms+sucorse 1 09·L一l;(2)Ms+sucorse 209·L一l;(3) Ms+sueorse309·L一l;(4)一泛Ms+sueorse rog·L一l;(5)1/2 MS+Sueorse 209·L一，;(6)l趁Ms+sucorse 309·L一‘。其中1/2 Ms培养基为大量元素减半的Ms培养基。以上培养基中均加入肌醇100mg’L一‘和0.75%琼脂。培养基Ms+sucrose 20g’L一‘在实生苗多项生长指标比较中表现最好，因此在实生苗组织培养体系中应选用这一培养基配方。 4.在基因转化体系建立方面，以称猴桃原生质体为材料，经PEG介导法，将表达载体pCA州巴IA1304携带的mGFPS基因转入称猴桃原生质体，在转化原生质体中发现了绿色荧光细胞，表明了绿色荧光蛋白(GFP)基因的瞬间表达，为称猴桃果实特异表达Actinidin一int嵌合基因转化体系建立工作打下了基础。综上所述，证明了称猴桃果实特异表达iPt基因已经构建成功，将为今后进行称猴桃遗传转化创造条件。从理论上讲，该果实特异表达基因可以保证iPt基因仅在称猴桃开花授粉之后幼果中开始有效表达，但由于称猴桃为多年生藤本植物，该嵌合基因的时空表达特异性尚需长期实验来证实。

全文目录

中文摘要  6-9
1 文献综述  9-25
  1.1 果树基因工程研究概况  9-13
    1.1.1 果树主要的基因转化方法  9-11
    1.1.2 基因工程在主要果树上的应用  11-13
  1.2 猕猴桃现代生物技术研究进展  13-20
    1.2.1 组织培养研究进展  15
    1.2.2 原生质体培养研究进展  15-17
    1.2.3 猕猴桃遗传转化研究进展  17-20
  1.3 IPT基因工程研究概况  20-25
2 引言  25-27
3 试验材料与方法  27-33
  3.1 试验材料  27-28
    3.1.1 质粒和基因  27
    3.1.2 试剂  27
    3.1.3 缓冲液及其溶液的配制  27
    3.1.4 培养基  27
    3.1.5 碱法提取质粒溶液  27-28
    3.1.6 实生苗培养体系起始材料  28
  3.2 试验方法  28-33
    3.2.1 果实特异表达ipt基因载体的构建  28-29
    3.2.2 质粒DNA提取  29-30
    3.2.3 质粒DNA的酶切与末端平滑化  30
    3.2.4 酶切产物的纯化与回收  30
    3.2.5 载体与片段的连接  30
    3.2.6 大肠杆菌DH5α感受态的制备  30-31
    3.2.7 连接产物的转化  31
    3.2.8 转化菌落的PCR检测  31
    3.2.9 酶切鉴定  31-32
    3.2.10 实生苗培养体系建立方法  32
    3.2.11 mGFP5基因转化原生质体  32-33
4 结果与分析  33-41
  4.1 不同载体的构建  33-37
    4.1.1 克隆载体pUC119Actinidin-ipt的构建  33-35
    4.1.2 植物表达载体pBI121-Actinidin-ipt的构建  35-37
  4.2 猕猴桃实生苗组织培养体系的建立  37-40
    4.2.1 赤霉素处理结果  37
    4.2.2 两种种子消毒方法对比结果  37-38
    4.2.3 六种不同培养基对猕猴桃组培幼苗生长状况的影响  38-40
  4.3 mGFP5基因转化  40-41
5 结论与讨论  41-44
  5.1 结论  41
  5.2 讨论  41-44
参考文献  44-51
英文摘要  51-54
图版  54

猕猴桃果实特异表达ipt基因的构建与转化体系建立的研究

内容摘要

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