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大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及S基因部分序列的测定和分析

作　者: 高凤山
导　师: 胡桂学；夏咸柱
学　校: 吉林农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 大熊猫分离和鉴定犬冠状病毒
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 83次
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内容摘要

本研究从某动物园两只死亡大熊猫的肝、脾等脏器分离病毒，经MDCK细胞适应培养，获得一株病毒(命名为DXMV)，在该细胞上可形成有规律的病变。电镜负染观察，病毒粒子有冠状纤突；超薄切片观察，于胞浆内形成病毒包涵体。理化学研究表明，该病毒为RNA病毒，对氯仿、乙醚敏感；胰酶试验中，经37℃、1小时处理的病毒，仍然能够在猫源细胞FCWF细胞上生长，并且毒力基本保持不变；耐酸性试验中，病毒分别在pH5.0和pH3.0经37℃作用2小时，毒力仅下降一个滴度；耐热性试验中，该病毒在恒定温度50℃，设定不同时间，从5分钟到150分钟，毒力均有不同程度下降，其中，50℃作用30分钟，病毒平均滴度下降2个单位；50℃，60分钟，CPE消失；恒定时间1小时，设定不同温度(50℃-60℃-70℃-80℃)，病毒在细胞上完全丧失增殖能力，CPE消失。生物学试验，利用实验室现有条件，选择不同的细胞系对该病毒进行培养，发现该病毒对猫源细胞FCWF最敏感；MDCK细胞次之；F81细胞经多次传代，亦可出现CPE；而Vero细胞则不敏感。血凝试验表明，该病毒对猪、鸡、人及豚鼠的红细胞均无血凝性。利用犬冠状病毒特异性血清经中和试验，初步可确定该分离病毒属于犬冠状病毒。分子生物学研究方面，先选用多聚酶区冠状病毒通用引物2Bp和4Bm，该引物含有多个兼并碱基，能扩增出11种冠状病毒；合成该引物，选择大熊猫肝组织原代病料和该分离病毒的各代细胞培养物，均成功地扩增出了目的片段，而未接毒FCWF对照细胞PCR扩增阴性；在此基础上，又选择犬冠状病毒特异性引物，该引物是一种套式(Nested)引物，位于S基因201-1286bp之间，包括两对引物，CCVF1-CCVR1；CCVF2-CCVR2。第一对引物为外层引物，可扩增出1086bp的核酸片段；第二对引物为内层引物，可扩增出515bp的核酸片段。该引物以K378为参考株，含有多个兼并碱基，可扩增出包括K378、Insavc-1、CCV1-71、NVSL吉林农业大学硕士学位论文大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及s墓因部分序列的测定和分析等多种犬冠状病毒。合成该套式引物，选择大熊猫原代病料和病毒各代细胞培养物，经套式(N ested)RT一PcR扩增，可得到一与设计值5巧bP相符的DNA片段，经BsT一xl(590，1110)酶切鉴定，证明该扩增片断为特异性片段;回收大熊猫肝组织原代病料和细胞培养物第2、3、29代的ccvFZ一ccvRZ扩增片段，纯化，送生物公司测序。序列用生物软件编辑，并比较各代次病毒基因序列，证明各代次病毒为同一种病毒;回收丸熊猫第3代细胞培养物ccvFI一ccvRI lo86bP的PcR扩增片段，纯化，测序，经生物软件编辑，得到一段1 o47bP的序列，然后与Genbank上发表的各ccv毒株的核替酸序列进行分析比较，得到该分离病毒与附sL、eevl一71、K37s、工n。avC一z的同源性分别达到了100%，99.5%，98.3%，88.5%;推导的氛基酸序列同源性分别达到了100%，98.9%，%.6%，90.5%。本研究首次从大熊猫体内分离和鉴定了ccv，揭示大熊猫亦可感染ccv，从而为大熊猫的疾病防治工作提供了必要的信息和资料，同时也丰富了冠状病毒尤其是犬冠状病毒的研究内容。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
前言  11-19
试验一   19-29
  1 材料和方法  19-21
    1.1 材料  19-20
      1.1.1 病料  19
      1.1.2 主要试剂  19
      1.1.3 主要仪器  19-20
      1.1.4 细胞  20
    1.2 方法  20-21
      1.2.1 病毒的分离  20
      1.2.2 病毒的形态学鉴定  20
      1.2.3 病毒的理化学鉴定  20-21
      1.2.4 病毒的生物学鉴定  21
      1.2.5 病毒的分子生物学鉴定  21
  2 结果  21-27
    2.1 病料的培养结果  21
    2.2 形态学鉴定结果  21-22
    2.3 理化学鉴定结果  22-25
    2.4 生物学鉴定结果  25-26
    2.5 中和试验鉴定结果  26-27
  3 讨论  27-28
    3.1 关于病毒的分离  27-28
    3.2 关于病毒的宿主范围  28
    3.3 关于病毒的特性  28
  4 小结  28-29
试验二  29-46
  1 材料和方法  29-35
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 病料  29
      1.1.2 主要试剂  29
      1.1.3 主要仪器  29-30
    1.2 病毒传代与培养  30
    1.3 引物设计  30-32
      1.3.1 通用引物设计  30-31
      1.3.2 特异性引物设计  31-32
    1.4 RNA提取  32
      1.4.1 病料的提取  32
      1.4.2 病毒细胞培养物的提取  32
    1.5 cDNA合成  32-33
      1.5.1 系统组成  32
      1.5.2 反转录  32-33
    1.6 PCR扩增  33-34
      1.6.1 通用引物扩增  33-34
      1.6.2 特异性引物扩增  34
    1.7 PCR产物纯化  34-35
    1.8 酶切鉴定  35
    1.9 基因序列测定和分析  35
      1.9.1 内层引物序列测定及分析比较  35
      1.9.2 外层引物序列测定及核苷酸和氨基酸序列分析比较  35
  2 结果  35-42
    2.1 PCR扩增结果  35-37
      2.1.1 通用引物PCR扩增结果  35-36
      2.1.2 特异性引物扩增结果  36-37
    2.2 酶切鉴定结果  37
    2.3 序列分析比较结果  37-42
      2.3.1 内层引物测定各代次病毒培养物的序列及比较结果  37
      2.3.2 外层引物测定DXMV3序列并与CCV多种毒株同源性分析比较  37-42
  3 讨论  42-45
    3.1 关于通用引物  42-43
    3.2 关于套式PCR及犬冠状病毒特异性引物  43
    3.3 关于CCV的其它毒株  43
    3.4 关于大熊猫犬冠状病毒的来源推测  43-44
    3.5 关于大熊猫犬冠状病毒与SARS病毒的关系  44-45
  4 小结  45-46
结论  46-47
参考文献  47-52
附图  52-58
附录一  58-59
附录二  59-60
附录三  60-61
附录四  61-62
附录五  62-63
附录六  63-64
致谢  64

大熊猫犬冠状病毒的分离鉴定及S基因部分序列的测定和分析

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