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CdR对Raji细胞的生物学特性及DNA结合抑制因子4的影响

作　者: 高献争
导　师: 李文才
学　校: 郑州大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: Id4 Raji细胞 5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶 FCM MS-PCR
分类号: R733.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景和目的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma,NHL）大约占淋巴瘤总数的80%-90%,是淋巴瘤最常见的类型。近几年的流行病学研究显示NHL对人类健康的威胁日益严重,在世界范围内呈普遍增长的趋势。目前NHL的治疗策略研究主要集中于多学科综合治疗,这就要求对病人进行准确的早期预防、诊断、分期、疗效评价、预后判断。而肿瘤标志物在这些方面起着相当重要的作用,在临床上被广泛应用。恶性淋巴瘤的病因及发病机制至今尚未明确,目前大部分的研究认为恶性淋巴瘤的病因可能与下列因素有关:病毒与细菌、免疫缺陷、环境因素及职业暴露、饮食、生活习惯、遗传因素、输血和外原性雌激素等。如近年一些学者提出了淋巴瘤的发病机制是人体感染某些病毒（如EBV）后,病毒侵入人体正常细胞内,可以引起基因融合或自发突变,也可引起机体的抗原受体基因变异和免疫功能缺陷,在合适的环境因素作用下就会诱导肿瘤的发生。但是似乎以上所有这些因素的最终作用结果都是导致基因结构改变或基因的表达改变,从而促使肿瘤的发生与发展。肿瘤的发生是一个复杂的多步骤的过程,其涉及与细胞增殖、分化、基因组整合有关的原癌基因、肿瘤抑制基因和细胞内的其他重要基因。研究显示多个DNA启动子区CpG位点的异常甲基化与多种肿瘤的发生发展有密切的关系。DNA结合抑制因子（inhibitor of DNA binding,Id）是DNA结合抑制剂,又称分化抑制因子,是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的核转录因子的负调控蛋白,包含四个Id家族成员,分别为Id1、Id2、Id3和Id4,其可能通过阻碍后者与DNA结合,进而抑制细胞分化,导致肿瘤的发生。研究显示Id蛋白与肿瘤细胞的增生、分化、凋亡和侵袭等生物性行为密切相关,在胚胎发生中发挥着关键作用,参与了血管生成、淋巴细胞的发展、细胞周期调控、细胞衰老及肿瘤的进展。Id1和Id2在多种肿瘤中表达增加,包括发生于结肠和胰腺的腺癌,将它们转基因表达于小鼠体内可导致肠上皮细胞和淋巴器官肿瘤形成。而Id3的表达则不同,在不同的肿瘤类型中呈上调或下调。Id4蛋白的表达也存在一定的分歧,如有研究显示Id分子在人体肿瘤组织及体外培养的肿瘤细胞中均呈高表达趋势,其中Id4在精原细胞瘤中有异常高表达;然而最近也有研究证明Id4蛋白在结肠癌和大多数胃癌细胞系中表达均下调。2004年于力等在国际上首次发现:DNA结合抑制因子4（Id4）基因在很多肿瘤细胞系中被甲基化,并发生基因沉默,致使该基因表达受抑,从而提出该基因很可能是一个新的抑癌基因,且可能和淋巴瘤的发展、预后有着密切的关系。该研究显示与正常组织相比,多种血液系统恶性肿瘤中也呈现Id4基因高甲基化改变。国外一篇文献报道Id4基因甲基化及其蛋白质表达的改变与结肠癌发生发展有着一定的关系。在正常组织中Id4基因很少发生甲基化,细胞质中蛋白表达较高;癌组织中则相反。研究表明Id4基因及其蛋白在多种细胞发育、分化中起着重要作用,不仅参与细胞周期调控,还参与调节肿瘤细胞增生、分化、侵袭等几个关键细胞生物学过程,并可能与肿瘤进展和预后有关。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases,DNMT）的作用下,以S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl methionine,SAM）作为供体将活化的甲基基团引入DNA链,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价结合一甲基团,形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,m5 C）。哺乳动物DNA中70%～80%CG序列的胞嘧啶残基在5’位被甲基化,称为甲基化的CpG位点。由甲基化所致的胞嘧啶5’位置的修饰是惟一已知自然发生的基因组的共价修饰。DNA甲基化模式与基因表达呈负相关。这种基因的碱基共价修饰在基因转录的调节、X染色体失活、基因印迹、细胞分化和肿瘤发生中都扮演了重要角色,以至有些科学家称之为“第五碱基”。DNA去甲基化制剂中主要是甲基转移酶抑制剂,作用机制是细胞毒作用和诱导去甲基化。其通过整合入DNA,抑制DNA甲基转移酶,在分裂细胞DNA复制过程中,使甲基不能转移到胞嘧啶上,降低DNA接受甲基的能力,从而随着分裂进行,DNA在子代细胞中的甲基化程度逐渐降低,使CpG岛甲基化后转录失活的抑癌基因恢复功能,从而逆转肿瘤细胞生物学活性。尽管目前还没有临床或分析生物学方面的指标能够明确预测哪种患者能对去甲基化药物有很好的反应,以及药物剂量、治疗周期对药效影响等方面的研究仍不成熟,但去甲基化制剂作为一种有效的恶性疾病的治疗方法已被重新重视。本实验分别采用免疫细胞化学、流式细胞术（FCM）、甲基化特异性聚合酶链反应（MS-PCR）等方法在体外观察去甲基化药物5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶（5-aza-2’-deoxyeytidine,CdR）对伯基特淋巴瘤（Burkitts’lymphoma）细胞株Raji细胞的细胞凋亡、细胞周期、Id4基因甲基化及Id4蛋白的表达的影响,探讨Id4基因对伯基特淋巴瘤的作用及意义。材料和方法1.主要药物及试剂:5-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶干粉剂,PBS溶解稀释后备用;Id4兔抗人多克隆抗体;一步法DNA碱基修饰试剂盒。2.细胞株及培养:人伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞购自中科院上海细胞生物学研究所,于新鲜RPMI 1640培养液（内含10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）中悬浮培养（37℃,5%CO₂）。3.取对数生长期细胞以2×10⁵/ml传代接种并分为6组,其中5组为处理组,分别以0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L CdR处理,另一组加入培养液作为对照组,于处理后第1、2、3、4、5、6、7天光镜下计数处理组与对照组细胞总数,绘制生长曲线。4.取对数生长期细胞以2×10⁵/ml传代接种并分为3组,一组加培养液作为空白对照组,另两组分别以0.5μmol/L、5.0μmol/L CdR处理,于处理24h、48h、72h后收集细胞,应用免疫细胞化学SP法、流式细胞术、MS-PCR分别检测CdR对Raji细胞Id4蛋白表达、细胞凋亡、细胞周期及Id4基因甲基化的影响。5.采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（（?）±s）表示,采用方差分析对实验数据进行统计学分析,检验标准以α=0.05为显著性检验水准。结果1.生长曲线测定结果:CdR不同浓度（0.0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L）处理后,在一定范围内随着剂量的增高和作用时间的延长,Raji细胞增殖速率逐渐降低。2.免疫细胞化学结果:未经CdR处理的Raji细胞（空白对照组）中,Id4蛋白呈低表达,仅表达于细胞质内;以0.5μmol/L、5.0μmol/L两种浓度CdR处理24h、48h、72h后细胞质Id4蛋白均较空白对照组表达增高,细胞核也有表达,且以5.0μmol/LCdR处理72h表达水平最高;相同时间段内随着CdR浓度增加,Id4蛋白表达增高,各时间段内处理组两两相比,差异均有统计学意义（P＜0.05）;相同CdR浓度处理下随着时间延长,Id4蛋白表达增高,各浓度内处理组两两相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.流式细胞技术检测结果:随着作用浓度的增高和作用时间的延长,Raji细胞凋亡比率增加。CdR处理相同时间段内不同浓度间细胞凋亡率经方差分析,差异有统计学意义（P＜0.05）;各浓度内不同时间段相比,差异有统计学意义（P＜0.05）。各处理组与对照组相比,细胞处于S期的比例增加,G0/G1和G2/M的比例下降（P＜0.05）;但处理组之间相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。4.MS-PCR检测结果:未经CdR处理和经0.5μmol/L CdR 24h处理的Raji细胞Id4基因呈完全甲基化状态,经0.5μmol/L CdR 48h、72h和5.0μmol/L CdR24h、48h处理的Raji细胞Id4基因呈部分甲基化状态,5.0μmol/L CdR 72h处理的Raji细胞Id4基因呈完全非甲基化状态。结论1.Raji细胞中Id4蛋白呈低表达,而CdR能够上调Id4蛋白的表达,且呈剂量一时间依赖性。2.CdR显著抑制Raji细胞的增殖、诱导细胞凋亡,且呈剂量一时间依赖性;CdR能够诱导细胞周期阻滞。3.未经CdR处理Raji细胞Id4基因呈完全甲基化改变;CdR能有效诱导Id4基因去甲基化改变。4.CdR促使Raji细胞凋亡的机制可能是通过上调Id4基因的表达而实现的。

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摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
论文部分  15-44
  CdR对Raji细胞的生物学特性及DNA结合抑制因子4的影响  15-44
    前言  15-19
    材料与方法  19-27
    实验结果  27-30
    讨论  30-34
    结论  34-35
    附图  35-39
    参考文献  39-44
综述部分  44-55
  淋巴瘤基因甲基化检测与去甲基化药物的研究新进展  44-55
    参考文献  51-55
中英文缩写词  55-56
致谢  56

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