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解盐促生菌Rs-5的ACC脱氨酶基因克隆及表达研究

作　者: 邓婷婷
导　师: 李春；李晖
学　校: 石河子大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盐胁迫解盐促生菌 ACDS基因棉花
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

为解决新疆棉田长期滴灌出现的土壤次生盐渍化问题,本论文以新疆不同生态环境的次生盐渍化土壤中自行筛选得到几株对棉花种子发芽和苗期生长具有显著促生功能的解盐促生菌产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca Rs-5（Genebank登录号为EF551363）及恶臭假单胞菌Pseudomonas putida Rs-198 （Genbank登录号为FJ788425）为对象,开展ACDS基因的克隆、载体构建及遗传转化研究,获得主要结果如下:根据Genbank上已报道的ACC脱氨酶基因序列设计并合成一对简并引物,以产酸克雷伯氏菌Rs-5基因组为模板,PCR扩增获得一条约1.0kb的特异片段。序列分析表明此基因具有完整的开放阅读框,编码区全长为1017bp,共编码338个氨基酸残基。由该基因（命名为Koacds）的DNA序列推导出的氨基酸序列与阴沟肠杆菌Enterobacterc loacae UW4和CAL2的ACC脱氨酶同源性分别为95.56%和96.75%。将上述基因与大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pDSK519连接,构建重组表达载体pDSK519-Koacds并转入大肠杆菌BL21中,获得的重组菌株命名为BL21-Koacds。全细胞蛋白电泳分析表明ACC脱氨酶基因已在重组基因工程菌中成功表达,且利用0.4mM的IPTG于25℃诱导5h后,蛋白表达量最大,比酶活可达0.192±0.042U/mg。通过电转化法将重组质粒导入到恶臭假单胞菌Rs-198并对转化效率的影响因素进行了研究。结果表明,以OD₆₀₀值为0.5的恶臭假单胞菌P. putida Rs-198细胞,在低温条件下制备感受态细胞(浓度为4.6×10¹²/ml ),并以0.3M的蔗糖为电转化介质,在13kV/cm的场强下电击可获得较高的转化效率,最高可达1.3×10⁷个转化子/μg DNA。重组菌株198-Koacds在28℃经0.4mM IPTG诱导5h后,SDS-PAGE电泳检测其蛋白表达量最大,此时比酶活为0.167±0.028U/mg。用转入ACC脱氨酶的重组菌株198- Koacds处理棉花种子,通过检测其发芽率、干重及株高等指标验证重组菌株的解盐促生能力。结果显示在NaCl浓度为0.7%时,产酸克雷伯氏菌Rs-5、恶臭假单胞菌Rs-198及重组菌株198-Koacds使棉花的发芽率分别平均提高了15.9%、16.8%及16.7%;棉花的干重分别平均提高了30.6%、31.0%及32.1%;棉花的株高分别平均提高了10.8%、13.6%及12.2%。利用野生型恶臭假单胞菌P. putida Rs-198与重组菌株198-Koacds ACC脱氨酶粗酶液混合处理棉花后,其发芽率提高了28.6%,表明ACC脱氨酶具有一定的解盐促生功能。重组菌株在LB培养基中及棉花根部的质粒稳定性试验结果表明:空质粒pDSK519与带有ACDS基因的重组质粒pDSK519-Koacd在LB培养基中经连续传代60小时后质粒丢失率基本达到稳定,在连续培养96小时后未丢失质粒所占百分比分别为68%和65%;而在植物根部连续传代96小时后两质粒几乎全部丢失。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
前言  8-12
主要符号表  12-13
第1章文献综述  13-28
  1.1 次生盐碱化的发生及其对作物的危害  13-14
    1.1.1 新疆耕地次生盐碱化的概况  13
    1.1.2 盐碱胁迫对作物的危害  13-14
  1.2 应对次生盐渍化危害的主要措施  14-15
    1.2.1 培育作物耐盐品种  14-15
    1.2.2 次生盐渍化土壤改良  15
  1.3 植物根围促生菌的研究及应用现状  15-16
  1.4 根际微生物提高植物耐盐性的机制  16-19
    1.4.1 营养调控机制  16-18
    1.4.2 激素调控机制  18-19
  1.5 乙烯生物合成途径中相关酶的研究现状  19-26
    1.5.1 ACC 酶家族  19-20
    1.5.2 ACC 脱氨酶一级结构  20-21
    1.5.3 ACC 脱氨酶的空间结构  21-22
    1.5.4 ACC 脱氨酶的生化特征  22-23
    1.5.5 ACC 脱氨酶在细菌自身的反应机制  23
    1.5.6 ACC 脱氨酶解除盐胁迫的原理  23-26
    1.5.7.2 ACDS基因的表达研究  26
  1.6 立论依据及主要研究内容  26-28
    1.6.1 立论依据  26-27
    1.6.2 主要研究内容  27-28
第2章材料与方法  28-41
  2.1 材料  28-31
    2.1.1 菌株来源,质粒  28
    2.1.2 棉花品种  28
    2.1.3 培养基及营养液  28-29
    2.1.4 仪器  29-30
    2.1.5 试剂  30-31
  2.2 方法  31-41
    2.2.1 ACC 脱氨酶基因的克隆及分析  31-35
    2.2.2 ACC 脱氨酶基因穿梭表达载体的构建  35-36
    2.2.3 外源质粒电击转入恶臭假单胞菌的条件研究  36-37
    2.2.4 重组菌株质粒稳定性测定  37
    2.2.5 重组菌株的诱导表达  37
    2.2.6 重组菌株的SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳  37-38
    2.2.7 ACC 脱氨酶活力的测定  38
    2.2.8 棉种处理及盆栽实验  38-39
    2.2.9 发芽率及干重测定  39
    2.2.10 蛋白质浓度的测定  39-41
第3章产酸克雷伯氏菌 Rs-5 的 ACC 脱氨酶基因克隆及序列分析  41-47
  3.1 引言  41
  3.2 细菌Rs-5 基因组总DNA 提取  41-42
  3.3 PCR 产物的鉴定  42
  3.4 ACDS 基因序列测定及分析  42-46
    3.4.1 ACDS 基因测序结果  42-43
    3.4.2 ACDS 基因序列分析  43-45
    3.4.3 ACC 脱氨酶蛋白结构预测  45-46
  3.5 小结  46-47
第4章 ACDS 基因表达载体的构建及在 E. coli BL21 中的表达  47-52
  4.1 引言  47
  4.2 表达载体 pDSK519-Koacds 转入 E. coli BL21 中  47-48
  4.3 质粒 pDSK519 及 pDSK519-Koacds 在 BL21 中的稳定性  48-49
  4.4 ACDS 基因在BL21 中的诱导表达  49-51
  4.5 小结  51-52
第5章 ACDS基因在 Rs-198中的表达及对棉花的解盐促生效应  52-62
  5.1 引言  52
  5.2 外源质粒电击转入P. putida的条件研究  52-57
    5. 2.1 P. putida Rs-198 的生长状态对转化效率的影响  52-54
    5.2.2 温度对转化效率的影响  54-55
    5.2.3 DNA 浓度及感受态细胞浓度对转化效率的影响  55
    5.2.4 电场强度及电转化介质对其转化效率的影响  55-57
  5.3 ACDS 基因在恶臭假单胞菌 P. putida Rs-198 中的诱导表达  57-58
  5.4 重组菌株 198- Koacds 对棉花的解盐促生效应研究  58-60
  5.5 质粒在恶臭假单胞菌P. putida Rs-198中的稳定性  60-61
  5.6 小结  61-62
第6章结论与展望  62-64
  6.1 结论  62-63
  6.2 展望  63-64
参考文献  64-69
致谢  69-70
作者简介  70-71
导师评阅表  71

解盐促生菌Rs-5的ACC脱氨酶基因克隆及表达研究

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