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甜杨PPP途径关键调控酶G6PDH的理化特性及抗冻机制

作　者: 罗磊
导　师: 林善枝
学　校: 北京林业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 甜杨抗冻锻炼 6-磷酸葡萄糖脱氢酶抗氧化系统 ASA-GSH循环
分类号: S792.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

甜杨（Populous suaveolens）属杨柳科杨属青杨派树种，主要分布于中国内蒙古东部及黑龙江大兴安岭，其生存区的年平均气温仅为-3.8℃，冬季气温为-27.4℃～-40.5℃，极端最低气温为-46.9℃，年平均降雨量仅为493.4mm，无霜期为93天。因此，甜杨是一种研究木本植物抗冻机制的理想材料。G6PDH是PPP途径的关键性调控酶，其主要功能是催化葡萄糖-6-磷酸氧化反应，所产生的某些中间产物（RU5P和E4P等）以及产生NADPH可为蛋白质、脂肪酸、氨基酸、固醇类等重要物质的生物合成提供各种反应底物和还原力，同时还涉及到多种环境胁迫而引起的植物应答反应。但至今未见有关木本植物G6PDH抗冻机制研究的成功报道。为了探讨和分析G6PDH在甜杨幼苗抗冻性的低温诱导中的可能作用机制，本研究以-20℃低温锻炼的甜杨幼苗为试材，以G6PDH活性变化为主线，以物质代谢、能量变化、抗氧化能力以及膜结构稳定因素等多角度分析为切入点，以细胞抗冻性和膜稳定性相关的生理生化指标的测定为依据，系统研究了NADPH、NADH、H₂O₂和MDA含量以及半致死温度LT₅₀，抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途径及糖酵解途径的关键性调控酶（G6PDH和PFK）活性以及抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶（APX、DHAR、MDAR和GR）活性在-20℃低温锻炼过程中的具体变化。对上述各理化指标间的内在联系，以及它们与G6PDH活性变化及抗冻性的相关性进行了分析，从中探讨了G6PDH在低温诱导甜杨幼苗抗冻性提高过程中的可能作用，以及低温诱导甜杨幼苗抗冻性提高的可能机理。进而阐明甜杨抗冻性的可能机制，为研究其他植物抗冻性及冻害发生机理提供科学的借鉴、重要的理论基础及相应的生理生化指标。另一方面，以已分离纯化的G6PDH为研究对象，研究了还原型二硫苏糖醇(DTT_red)、pH值、代谢物及金属离子对G6PDH活性的影响，并对该酶催化反应特性进行分析，进而探讨G6PDH与抗冻性的关系。通过上述研究，可得到以下主要结果：1．以甜杨G6PDH活性变化与抗冻性的关系为主线，以细胞抗冻性和膜稳定性相关的各种生理生化指标的测定为依据，对在-20℃低温锻炼及脱锻炼过程中幼苗体内的NADPH、NADH、H₂O₂和MDA含量，半致死温度LT₅₀，抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量，抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，磷酸戊糖途径及糖酵解途径的关键性调控酶（G6PDH和和PFK）活性，以及抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶（APX、DHAR、MDAR和GR）活性和蛋白质含量的动态变化进行了系统研究，并对上述各理化指标间的内在联系，以及它们与G6PDH活性变化及抗冻性的相关性进行分析，这在国内外上尚未报道。实验结果表明，低温锻炼所引起的抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性、抗坏血酸-谷胱甘肽循环的关键性调控酶（APX、DHAR、MDAR和GR）活性、抗氧化剂ASA、DHA、GSH及GSSG含量以及蛋白质含量的变化与G6PDH活性变化密切相关，而且这些指标的变化与幼苗MDA含量、H₂O₂含量以及半致死温度LT₅₀的降低密切相关。由此可认为G6PDH可能参与了甜杨幼苗抗氧化酶活性及抗坏血酸-谷胱甘肽循环运转能力的调节、抗氧化剂和膜结构稳定性相关物质的合成以及抗冻性的低温诱导，是甜杨抵御冰冻低温的一种重要生理物质。2．为了探讨低温锻炼对不同糖代谢途径的影响效应，对在低温锻炼和脱锻炼中的G6PDH和PFK活性以及NADPH和NADH含量的变化进行比较分析，结果发现，在-20℃低温锻炼中，幼苗枝条内的NADH含量的增加幅度以及PFK活性的提高程度分别不如NADPH含量和G6PDH活性明显，但脱锻炼所引起的下降程度却分别比NADPH含量和G6PDH活性显著。这说明低温锻炼对酵解途径的影响效应相对较小，反映出不同糖代谢途径对低温胁迫应答具有一定的差异。据此可认为，低温锻炼可能引起了体内糖代谢途径的改变与能量的适应性变化，而甜杨幼苗在低温下可能主要是通过PPP途径来产生高水平的NADPH，才能满足与抗冻性发育有关的RNA、蛋白质等生物合成的需要。3．细胞抗氧化能力与抗冻性关系的研究结果表明，低温锻炼所引起的SOD、POD和CAT活性提高的幅度均小于APX、DHAR、MDAR和GR、而且也小于抗氧化剂ASA、DHA、GSH和GSSG含量的增加幅度；另外，脱锻炼2d后，经低温锻炼的幼苗其体内APX、DHAR、MDAR、GR、ASA、DHA、GSH和GSSG下降幅度均小于SOD、POD和CAT，而且APX、DHAR、MDAR和GR活性以及ASA、DHA、GSH和GSSG含量仍高于未锻炼幼苗水平。由此可见，不同抗氧化酶在细胞内清除H₂O₂的过程中所起的作用存在着一定的差异，在低温胁迫下甜杨幼苗内H₂O₂的清除主要是通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环来实现的。这也在一定程度上反映出低温锻炼的幼苗在脱锻炼后还能保持较高的抗坏血酸-谷胱甘肽循环能力和清除H₂O₂能力，可能与维持脱锻炼后幼苗恢复正常生长的需要有关。4．首次以从-20℃低温锻炼的甜杨幼苗中分离纯化的G6PDH为研究对象，研究了还原型二硫苏糖醇(DTT_red)、pH值、代谢物及金属离子对G6PDH活性的影响，并对该酶催化反应特性进行分析。结果发现，所分离纯化的G6PDH定位于细胞质、其最适反应pH值为8.2，而且NADPH、NADH、GTP、UTP、ATP、AMP、ADP、CoA、Acetyl CoA、F6P、E4P、R5P和3-PG处理对该酶活性均有不同程度抑制，其中NADPH抑制作用较强；Mg²⁺、Ca²⁺和K⁺对该酶活性没有影响，而Cd²⁺对该酶活性有较强的抑制作用。另外，该酶的最大反应速度为68U／mg protein，底物G6P和NADP的米氏常数（K_m）分别为360μmol／L和16μmol／L，表明甜杨细胞质的G6PDH活性高于已报道的其他植物材料的G6PDH活性。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
引言  13-15
1 文献综述  15-26
  1.1 植物抗冻性研究进展  15-20
    1.1.1 低温锻炼过程中体内代谢的变化  15-16
    1.1.2 细胞膜体系与抗冻性的关系  16
    1.1.3 抗氧化系统对低温胁迫的生化响应  16-17
    1.1.4 抗冻基因的分离和鉴定  17
    1.1.5 植物抗冻基因工程  17-20
      1.1.5.1 导入植物低温诱导表达基因  18
      1.1.5.2 导入超氧化物歧化酶(SOD)基因  18-19
      1.1.5.3 导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因  19
      1.1.5.4 导入植物抗冻蛋白基因  19
      1.1.5.5 导入动物抗冻蛋白基因  19-20
  1.2 杨树抗冻性的研究进展  20-21
  1.3 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)研究进展  21-24
    1.3.1 植物中的戊糖磷酸途径  22
    1.3.2 植物G6PDH的生物学功能  22-23
    1.3.3 植物G6PDH的特性  23-24
    1.3.4 植物G6PDH基因的研究现状  24
  1.4 本研究的主要内容及立题依据  24-26
2 甜杨G6PDH的分离纯化及理化特性研究  26-30
  2.1 材料与方法  26-27
    2.1.1 材料  26
    2.1.2 方法  26-27
      2.1.2.1 G6PDH的提取、纯化及纯度鉴定  26
      2.1.2.2 G6PDH特性分析  26-27
  2.2 结果与分析  27-30
    2.2.1 G6PDH的分离纯化及纯度鉴定  27
    2.2.2 pH和还原型二硫苏糖醇处理对G6PDH活性的影响  27-28
    2.2.3 不同代谢物和金属离子对G6PDH活性的影响  28-29
    2.2.4 G6PDH动力学参数的分析  29-30
3 甜杨G6PDH的抗冻特性研究  30-43
  3.1 材料与方法  30-32
    3.1.1 材料  30
    3.1.2 方法  30-32
      3.1.2.1 幼苗LT_(50)的测定  30
      3.1.2.2 POD、SOD、CAT和MDA的提取与活性测定  30-31
      3.1.2.3 ASA、DHA、GSH和GSSG的提取与含量测定  31
      3.1.2.4 APX、GR、MDAR和DHAR的提取与活性测定  31
      3.1.2.5 NADPH、NADH和H_2O_2的提取与含量测定  31
      3.1.2.6 G6PDH的提取、纯化及活性测定  31
      3.1.2.7 PFK的提取与活性测定  31
      3.1.2.8 蛋白质的提取与含量测定  31-32
      3.1.2.9 统计分析  32
  3.2 结果与分析  32-43
    3.2.1 低温锻炼对LT_(50)和MDA的影响  32-33
    3.2.2 低温锻炼对H_2O_2含量及其代谢相关的关键性酶活性的影响  33-36
    3.2.3 低温锻炼对G6PDH活性和NADPH含量的影响  36-39
    3.2.4 低温锻炼对DHA、ASA、GSH和GSSG含量的影响  39-40
    3.2.5 低温锻炼对PFK活性和NADH含量的影响  40-41
    3.2.6 低温锻炼对蛋白质含量的影响  41-43
4 讨论  43-49
  4.1 甜杨G6PDH的细胞定位、生理生化特性及动力学参数  43-44
  4.2 细胞抗氧化能力与植物抗冻性的关系  44-46
  4.3 糖代谢途径的改变及G6PDH活性与植物抗冻性的关系  46-49
5 结论  49-51
参考文献  51-62
个人简介  62-63
导师简介  63-64
获得成果目录清单  64-65
致谢  65

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