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酶解多肽一级序列分析与反应过程建模及结构变化初探

作　者: 刘瑞
导　师: 何志敏
学　校: 天津大学
专　业: 化学工程
关键词: 蛋白质多肽序列 HPLC-ESI-MS/MS 酶解神经网络岭回归动力学模型
分类号: O629.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

蛋白质酶促水解反应是在酶的专一性催化作用下使蛋白质水解生成胨、肽等低分子量产物的过程。由于蛋白质高级结构复杂、酶作用位点众多,使得酶解过程具有产物多样性和反应复杂性等特点。本论文在课题组已有研究工作基础上,利用色谱/质谱联用技术以及动态光散射检测方法等多种先进的分析测试手段,从一级序列分析到动力学过程模拟以及高级结构解析等多层次,对蛋白质酶解过程进行了较为详细的研究。具体内容如下:酶解产物反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析条件的确定:选取一级序列已知的牛血清白蛋白(BSA)和断裂位点高度专一的胰蛋白酶(Trypsin)组成模式酶解体系,确定了反相色谱的紫外检测波长为214nm,流动相为水-乙腈-三氟乙酸(TFA)。通过研究流动相中水相-有机相的梯度条件、流动相中离子对试剂TFA含量及流动相流速等因素对分离效果的影响,确定了针对此体系复杂产物分析的适宜梯度洗脱条件,即流动相中TFA含量为0.08%,流动相流速为1.0mL/min。酶解产物液质分析及产物多肽一级序列的确定:采用已确定的反相色谱分析条件,利用RP-HPLC对BSA-trypsin体系酶解全过程中9个不同水解度下的酶解产物进行了色谱分析,并应用液质联用(LC-ESI-MS/MS)技术对产物多肽序列进行了解析。通过bioworks软件和人工检索比对的方法对所得质谱数据进行解析,最终确定出各水解度下不同酶解产物所含的33个多肽的一级序列。酶解多肽色谱保留行为预测模型的建立:运用最小二乘与岭回归两种算法,建立了BSA-Trypsin体系产物多肽的反相色谱保留时间预测模型,经相关分析与残差检验证明:对于酶解多肽,岭回归算法因消除了数据的多重共线性影响,而使所建模型较最小二乘法拟合效果更佳;且对于不同多肽体系,各种模型之间的通用性不强,本文所建模型尤其适于酶解所得多肽的保留时间预测。水解度值预测模型的建立:酶解过程中,水解条件(如底物浓度S、酶浓度E、酶解温度T、酶解pH值以及酶解时间t等)直接影响水解度(DH)值的大小,故其反应机理非常复杂。本文引入神经网络模型的概念,以S、E、T、pH和t作为输入,以DH作为输出,建立了一个由输入层(5个神经元)、两层隐含层(分别含4个神经元和5个神经元)和输出层(5个神经元)构成的神经网络模型。利用大量酶解条件-水解度值数据对模型进行训练和验证,最终建立了较理想的预测反应过程中水解度值的黑箱模型。多肽酶解释放动力学模型的建立:根据不同水解度时酶解产物的质谱总离子

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
前言  11-13
第一章文献综述  13-32
  1.1 蛋白及蛋白水解多肽国内外研究进展  13-19
    1.1.1 水解蛋白的来源研究近况  13-16
    1.1.2 蛋白水解生成活性多肽的研究进展  16-19
      1.1.2.1 蛋白质水解方法及蛋白水解酶  16-17
      1.1.2.2 蛋白水解生成多肽的研究进展  17-19
  1.2 高效液相色谱技术在生化上的应用研究进展  19-21
    1.2.1 高效液相凝胶排阻色谱（HPSEC）的应用研究进展  19-20
    1.2.2 高效液相反相色谱（RP-HPLC）的应用研究  20-21
  1.3 质谱技术在生化中的应用及发展近况  21-25
    1.3.1 不同离子化的方法及应用研究  21-24
      1.3.1.1 电子轰击电离（EI）  22
      1.3.1.2 化学电离（CI）  22
      1.3.1.3 快原子轰击电离（FAB）  22-23
      1.3.1.4 电喷雾电离（ESI）  23
      1.3.1.5 大气压化学电离（APCI）  23-24
      1.3.1.6 基质辅助激光解吸电离（MALDI）  24
    1.3.2 生物质谱研究应用的发展近况  24-25
  1.4 光散射技术在高分子及生物大分子领域的研究进展  25-27
    1.4.1 静态光散射技术在高分子及生物大分子领域的应用  26
    1.4.2 动态光散射技术在高分子及生物大分子领域的应用  26-27
  1.5 化学计量学在化工及生化中的应用  27-30
    1.5.1 回归分析  27-28
    1.5.2 人工神经网络  28-30
    1.5.3 主成分分析  30
  1.6 本课题研究主要内容  30-32
第二章 BSA－trypsin 体系酶解物反相色谱分析条件优化  32-40
  2.1 实验仪器与材料  32-33
    2.1.1 实验仪器与设备  32
    2.1.2 实验材料  32-33
  2.2 实验方法  33-34
    2.2.1 trypsin 酶活的测定  33
    2.2.2 BSA-trypsin 水解物的制备  33
    2.2.3 水解度的计算  33-34
    2.2.4 酶解产物的色谱分析  34
  2.3 结果与讨论  34-39
    2.3.1 紫外检测波长的选择  34-35
    2.3.2 反相色谱梯度洗脱条件的选择  35-36
    2.3.3 流动相中TFA 含量的选择  36-38
    2.3.4 流动相流速的选择  38-39
  2.4 小结  39-40
第三章 BSA-trypsin 体系酶解全过程反相色谱分析及液质联用解析  40-53
  3.1 实验仪器与材料  40-41
    3.1.1 实验仪器与设备  40
    3.1.2 实验材料  40-41
  3.2 实验方法  41-43
    3.2.1 BSA 二硫键的断裂  41-42
    3.2.2 BSA-trypsin 水解物的制备  42
    3.2.3 酶解产物的RP-HPLC 分析  42
    3.2.4 酶解产物的LC-ESI-MS/MS 分析  42
    3.2.5 质谱数据的分析——多肽序列的确定  42-43
  3.3 结果与讨论  43-52
    3.3.1 酶解过程水解度的计算  43
    3.3.2 酶解全过程反相色谱分析  43-45
    3.3.3 酶解全过程产物液质联用分析及所含多肽序列的确定  45-50
    3.3.4 BSA-胰蛋白酶体系酶解片段序列分析示例  50-52
  3.4 小结  52-53
第四章 BSA－trypsin 酶解产物多肽反相色谱保留行为预测  53-62
  4.1 理论基础  53-55
    4.1.1 多肽反相色谱保留行为预测方法  53
    4.1.2 最小二乘算法曲线拟合(least square linear regression)  53-54
    4.1.3 岭回归算法曲线拟合(ridge regression)  54-55
    4.1.4 实验拟合优度检验  55
  4.2 拟合所需数据来源  55-56
  4.3 酶解多肽反相色谱保留行为的预测  56-61
    4.3.1 不同方法对酶解多肽反相色谱保留时间的拟合  56-60
    4.3.2 不同模型预测多肽色谱保留时间的比较  60-61
  4.4 小结  61-62
第五章 BSA-trypsin 体系水解度值的神经网络拟合及活性多肽酶解释放动力学模型的建立  62-79
  5.1 基于酶解条件的水解度值模型  62-70
    5.1.1 BP 神经网络理论基础  62-63
    5.1.2 不同酶解条件下水解度值的数据来源  63-67
    5.1.3 水解度值神经网络模型的建立与验证  67-68
    5.1.4 模型结果的分析  68-70
  5.2 酶解多肽释放动力学模型  70-78
    5.2.1 模型建立基础  70-71
    5.2.2 不同水解度时酶解多肽含量的数据来源  71-72
    5.2.3 酶解多肽释放动力学模型的建立  72-76
    5.2.4 酶解多肽释放动力学模型的分析及应用  76-78
  5.3 小结  78-79
第六章酪蛋白溶解及酶解过程中高级结构变化的研究  79-87
  6.1 酪蛋白分子简介及其高级结构研究近况  79-80
  6.2 实验仪器与材料  80-81
    6.2.1 材料与设备  80
    6.2.2 实验材料  80-81
  6.3 实验方法  81
    6.3.1 样品制备  81
    6.3.2 测试方法  81
      6.3.2.1 不同离子强度对酪蛋白胶束粒径的影响实验  81
      6.3.2.2 温度变化对酪蛋白胶束粒径的影响实验  81
      6.3.2.3 酶解过程中酪蛋白胶束粒径变化实验  81
  6.4 理论基础  81-82
  6.5 结果与讨论  82-86
    6.5.1 不同离子强度对酪蛋白胶束Rh 值的影响  82-83
    6.5.2 升温与降温过程中酪蛋白胶束Rh 值的变化规律  83-85
    6.5.3 酶解过程中酪蛋白胶束Rh 值的变化规律  85-86
  6.6 小结  86-87
第七章结论与展望  87-89
  7.1 结论  87-88
  7.2 展望  88-89
参考文献  89-95
发表论文及参加科研情况  95-96
附录  96-106
致谢  106

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