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核糖核酸酶A的体外重折叠过程研究

作　者: 谭培生
导　师: 关怡新
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 核糖核酸酶A 二硫键蛋白质体外重折叠折叠机理稀释复性荧光光谱法折叠酶DsbA
分类号: TQ936.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

如何对富含二硫键的包涵体蛋白进行高效的体外复性使其获得正确的空间结构是重组蛋白生产所面临的巨大挑战,现已成为制约生物工程技术产业化的瓶颈问题之一。本文以核糖核酸酶A（RNase A）为蛋白质体外重折叠的模型蛋白,对其体外重折叠过程进行了研究,探讨了这类目标蛋白复性过程的一些规律性的问题。首先利用脲和DTT作为变性剂,研究了脲和DTT浓度对RNase A的酶活和自由巯基的影响规律。确定了初始蛋白浓度为10mg/mL的RNase A完全变性条件为8M脲,20mM DTT。其次,利用完全变性的RNase A研究了体外稀释复性过程,在蛋白复性初始浓度为100μg/mL、pH8.0、GSH浓度为2mM、GSH/GSSG比例为4∶1～2∶1、脲浓度为0.5～2.0M时具有较好的复性效果,活性收率可达初始酶活的80～90%。利用荧光光谱法表征了复性过程蛋白质结构的变化,从荧光光谱和酶活变化规律分析可知:蛋白质复性过程首先是二级结构和疏水结构的形成,然后才是三级结构和二硫键的形成。利用二级聚集反应动力学模型对实验数据进行拟合,经计算得到浓度在0.1～2.0mg/mL范围的RNase A,拟合相关系数为0.98～0.998。随着复性液中蛋白浓度的增加,聚集沉淀速率加快,正确折叠速率减慢;此外,在复性液中添加低浓度的脲能有效促进RNase A的正确折叠。再次,研究了折叠酶DsbA的制备,包括质粒转化、发酵培养、细胞收集、破胞和离子交换层析等,对发酵和纯化工艺进行了优化,获得了高纯度的目标蛋白DsbA,其浓度为176mg/L,分离过程收率为94.4%,纯度达到95%以上,DsbA产量达到了365±1.6mg/L发酵液。最后,在复性缓冲液中添加DsbA辅助变性RNase A体外重折叠。实验结果表明DsbA不仅能提高多肽链折叠的速率,还能提高复性后酶活收率,这是由DsbA的氧化性、异构酶的性质,兼具分子伴侣的功能所决定的。由复性动力学模型对实验数据的拟合结果表明,DsbA的存在能提高正确折叠的速率常数k₂,而对形成聚集体的速率常数k₃影响较小,因此其综合效果是k₂/k₃的增大,促进了多肽链向正确的空间结构折叠,形成具有天然态结构的蛋白质分子。

全文目录

绪论  11-12
第一章文献综述  12-28
  1.1 引言  12-13
  1.2 蛋白质折叠复性的方法学基础  13-16
    1.2.1 包涵体的形成  13
    1.2.2 蛋白质的变性和复性  13-15
    1.2.3 蛋白质的折叠路径及聚集体的产生  15-16
  1.3 蛋白质体外复性的方法  16-20
    1.3.1 透析和稀释复性法  16-17
    1.3.2 层析折叠复性  17-18
    1.3.3 折叠促进剂协助复性  18-19
    1.3.4 分子伴侣及折叠酶协助复性  19
    1.3.5 其他复性方法  19-20
  1.4 二硫键的形成及二硫键异构酶  20-22
    1.4.1 蛋白质折叠过程与二硫键的形成  20-21
    1.4.2 二硫键异构酶及其生物学性质  21-22
      1.4.2.1 二硫键异构酶的异构酶活性  21-22
      1.4.2.2 二硫键异构酶的分子伴侣活性  22
  1.5 疏基氧化还原蛋白Dsb家族与DsbA  22-25
    1.5.1 Dsb蛋白的发现  22-23
    1.5.2 Dsb家族概况  23
    1.5.3 DsbA的结构与性质  23-25
  1.6 蛋白质折叠研究的实验技术  25-26
    1.6.1 荧光光谱法  25-26
    1.6.2 圆二色光谱法  26
  1.7 本文研究思路  26-28
    1.7.1 核糖核酸酶A  26-27
    1.7.2 本文研究思路  27-28
第二章核糖核酸酶A的变性  28-39
  2.1 引言  28-29
  2.2 实验材料与仪器  29
    2.2.1 主要试剂  29
    2.2.2 仪器设备  29
  2.3 实验方法  29-34
    2.3.1 自由疏基测定方法  29-30
    2.3.2 蛋白质含量的测定─考马斯亮蓝法  30-31
    2.3.3 RNaseA活性测定  31-33
    2.3.4 RNaseA的荧光结构表征  33-34
  2.4 实验结果和讨论  34-38
    2.4.1 脲对RNase A变性作用  34
    2.4.2 DTT对RNaseA变性的影响  34-35
    2.4.3 变性过程 RNase A的性质变化  35-37
    2.4.4 RNaseA变性过程机理探讨  37-38
  2.5 本章小结  38-39
第三章核糖核酸酶 A的稀释复性及复性动力学研究  39-61
  3.1 引言  39-42
  3.2 实验材料与仪器  42
    3.2.1 主要试剂  42
    3.2.2 仪器设备  42
  3.3 实验方法  42
    3.3.1 RNase A的变性  42
    3.3.2 RNase A的稀释复性  42
  3.4 RNaseA的稀释复性  42-51
    3.4.1 稀释倍数对RNaseA复性的影响  43-44
    3.4.2 复性温度对 RNase A复性的影响  44
    3.4.3 氧化还原环境对 RNase A复性的影响  44-47
    3.4.4 pH值对 RNaseA复性的影响  47
    3.4.5 脲浓度对 RNase A复性的影响  47-48
    3.4.6 凝集抑制剂对 RNase A复性的影响  48-49
    3.4.7 荧光光谱法表征 RNase A复性过程空间结构的变化  49-51
      3.4.7.1 RNase A复性荧光光谱  49-50
      3.4.7.2 RNase A体外重折叠过程机理  50-51
  3.5 RNase A复性动力学研究  51-59
    3.5.1 动力学模型的提出  51-52
    3.5.2 动力学模型的求解  52-53
    3.5.3 实验结果与复性动力学模型分析  53-59
      3.5.3.1 数据拟合及动力学常数的求取  53-57
      3.5.3.2 蛋白质初始浓度对复性动力学常数的影响  57
      3.5.3.3 脲浓度对复性动力学常数的影响  57-59
      3.5.3.4 对复性动力学模型的评价  59
  3.6 本章小结  59-61
第四章折叠酶 DsbA的发酵与纯化  61-71
  4.1 引言  61
  4.2 实验材料与仪器  61-64
    4.2.1 菌种与质粒  61-63
    4.2.2 培养基  63
    4.2.3 实验仪器  63
    4.2.4 层析系统  63
    4.2.5 溶液  63-64
  4.3 实验方法  64-66
    4.3.1 质粒抽提  64
    4.3.2 感受态细胞的制备  64
    4.3.3 质粒的转化  64
    4.3.4 DsbA的发酵制备  64-65
    4.3.5 基于统计原理的实验设计  65
    4.3.6 细胞破碎  65
    4.3.7 离子交换法纯化DsbA  65-66
  4.4 实验结果和讨论  66-70
    4.4.1 DsbA的表达  66-67
    4.4.2 DsbA表达条件的优化  67-69
    4.4.3 离子交换层析法纯化DsbA  69-70
  4.5 本章小结  70-71
第五章 DsbA介导的核糖核酸酶A体外复性初步研究  71-77
  5.1 引言  71
  5.2 实验材料与仪器  71
    5.2.1 实验材料  71
    5.2.2 实验仪器  71
  5.3 实验方法  71-72
    5.3.1 透析袋的预处理  71-72
    5.3.2 DsbA的浓缩  72
    5.3.3 DsbA协助RNase A的体外复性  72
  5.4 实验结果与讨论  72-76
    5.4.1 DsbA对RNase A折叠速率的影响  72-74
    5.4.2 DsbA对RNase A复性酶活回收率的影响  74
    5.4.3 DsbA对RNase A复性动力学常数的影响  74-76
  5.5 本章小结  76-77
第六章结论与建议  77-79
  6.1 结论  77-78
  6.2 建议  78-79
参考文献  79-84
符号说明  84-85
致谢  85-86
攻读硕士学位期间发表论文情况  86

核糖核酸酶A的体外重折叠过程研究

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