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苹果组培苗RT-PCR体系建立及外源CpTI基因在mRNA水平表达的研究

作　者: 张鑫
导　师: 杜国强
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果组培苗总RNA 提取 RT-PCR
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

以转CpTI基因苹果（Malus domestica Borkh）组培苗（包括红富士、乔纳金、王林和皇家嘎拉等60个株系）为试材,对苹果组培苗中的外源CpTI基因进行了反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测技术研究。采用的技术流程为:通过提取苹果组培苗中总RNA获得CpTI的RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增获得CpTI的特征片段。本研究对RNA提取方法进行了研究,比较了目前常用的几种提取植物组织中总RNA的方法,建立了RT-PCR检测技术体系。主要研究结果如下: 1.酚类化合物、多糖、蛋白质和次级代谢产物是影响从苹果组织中提取总RNA的几个主要干扰因素。试验比较和改进了RNAplant试剂盒法、CTAB-异硫氰酸胍法、改良CTAB法、尿素法和热硼酸法等五种常用的植物组织总RNA提取方法。通过对RNA的质量、提取效率、提取时间以及试剂费用等多方面进行比较,提出改良CTAB法为从苹果组培苗中提取总RNA的最佳方法。该方法的提取缓冲液包括2%CTAB,2.0mol/L NaCl,100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）,20 mmol/LEDTA（pH 8.0）,2%β-巯基乙醇（使用前加入）。该方法有效地去除了酚类化合物、多糖、蛋白质等污染,在3小时之内可得到高纯度、完整的、适宜进行RT-PCR操作的RNA模板,从而保证了检测的成功。 2.利用DNase I去除RNA中的DNA后,采用M-MLV反转录酶,建立了适合苹果组培苗的反转录体系,合成的cDNA片段在100～1500bp之间,可满足对cDNA分析的要求。 3.依据CpTI基因序列设计合成特异引物,采用RT-PCR的方法扩增出了309bp的PCR产物,与预期目的片段长度一致。 4.适合苹果组培苗RT-PCR分析体系为:在反转录体系中,引物使用浓度为0.8μmol/L,RNA模板的用量为1.0 μg;PCR选用25 μL体系,引物浓度为0.6 μmol/L,Mg²⁺浓度为1.6 mmol/L,dNTPs浓度为300 μmol/L,Taq酶用量为1.5U;PCR扩增程序为:94℃,2mins;94℃,50s,55℃,50s,72℃,100s;30循环;72℃,10mins;4℃保温。 5.对外源CpTI在60个株系苹果组培苗中的表达进行RT-PCR检测,结果如下:54和60号2个株系没有得到目的片段,42～50、52、55～59等15个株系得到的目的片段亮度暗,其余43个株系得到的目的片段明亮。

全文目录

1 引言  10-19
  1.1 抗虫基因的种类及抗虫原理  11-13
    1.1.1 苏云金芽孢杆菌  11-12
    1.1.2 蛋白酶抑制剂基因  12
    1.1.3 外源凝集素基因  12-13
    1.1.4 淀粉酶抑制剂基因  13
    1.1.5 动物来源的抗虫基因  13
  1.2 植物抗虫基因工程的研究  13-15
    1.2.1 Bt毒蛋白基因在植物上的应用  13-14
    1.2.2 蛋白酶抑制剂在植物上的应用  14-15
  1.3 植物抗虫基因工程存在的问题及其对策  15-16
  1.4 RT-PCR技术  16-19
    1.4.1 RT-PCR技术原理  16
    1.4.2 RT-PCR检测技术种类  16-17
    1.4.3 RT-PCR的影响因素  17-18
    1.4.4 RT-PCR的发展方向  18-19
2 材料与方法  19-27
  2.1 材料  19-20
    2.1.1 试验材料  19
    2.1.2 主要试剂、酶、试剂盒  19
    2.1.3 所用引物  19-20
    2.1.4 主要仪器与设备  20
  2.2 试验方法  20-26
    2.2.1 PCR扩增目的基因  20-21
    2.2.2 苹果组培苗RNA的提取及鉴定  21-24
    2.2.3 RT-PCR体系的建立  24-26
  2.3 外源CpTI在苹果组培苗中表达的检测  26
  2.4 主要试剂的配制方法  26-27
3 结果与分析  27-43
  3.1 PCR扩增目的基因  27-29
    3.1.1 适于苹果组培苗基因组DNA提取方法的研究  27-28
    3.1.2 苹果组培苗基因组DNA的提取  28-29
    3.1.3 苹果组培苗基因组DNA扩增CpTI基因  29
  3.2 苹果组培苗总RNA的提取  29-35
    3.2.1 不同方法提取苹果组培苗总RNA的比较  29-31
    3.2.2 改良CTAB法提取RNA体系的优化  31-33
    3.2.3 提取不同时期组培苗RNA的产率和纯度  33
    3.2.4 离体RNA在不同条件下的保存结果  33-34
    3.3.5 RNA的纯化结果  34-35
  3.3 RT-PCR体系的建立  35-41
    3.3.1 cDNA第一链的合成  35
    3.3.2 cDNA第一链合成引物的筛选  35-36
    3.3.3 cDNA第一链合成引物浓度对产物的影响  36
    3.3.4 cDNA第一链合成中RNA模板的浓度对合成产物的影响  36-37
    3.3.5 PCR反应中引物的选择  37-38
    3.3.6 PCR反应引物浓度的优化  38
    3.3.7 Mg~(2+)浓度对扩增产物的影响  38
    3.3.8 dNTPs浓度对扩增产物的影响  38-39
    3.3.9 Taq酶用量对扩增产物的影响  39-40
    3.3.10 退火温度对扩增产物的影响  40-41
    3.3.11 RT-PCR体系的优化结果  41
  3.4 RT-PCR检测外源基因在苹果组培苗中的表达  41-43
4 讨论  43-48
  4.1 苹果组培苗总RNA的提取  43
  4.2 防止RNA的降解  43-44
  4.3 RT-PCR体系的建立  44-45
    4.3.1 PCR条件的选择  44-45
    4.3.2 PCR产物的电泳检测  45
    4.3.3 PCR技术检测的可靠性和灵敏度  45
  4.4 引物设计  45-46
  4.5 转基因沉默的分子机理  46-48
5 结论  48-49
参考文献  49-54
在读期间发表的学术论文  54-55
作者简介  55-56
致谢  56

苹果组培苗RT-PCR体系建立及外源CpTI基因在mRNA水平表达的研究

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