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RNA干扰抑制硫氧还蛋白基因增强人脑胶质瘤U251对三氧化二砷敏感性的研究

作　者: 汪润
导　师: 孙茂民
学　校: 苏州大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: RNA干扰硫氧还蛋白胶质瘤三氧化二砷凋亡
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:探讨硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）在人胶质瘤U251对三氧化二砷（arsenic trioxide, As₂O₃）的敏感性中的作用。方法:（1）用5μmol/L As₂O₃分别处理U251细胞不同的时间梯度:0 h,6 h,12 h,24 h和48 h,采用MTT法和Hoechst 33242染核法检测5μmol/L As₂O₃处理对U251增殖和凋亡的影响。采用免疫细胞化学方法检测5μmol/L As₂O₃处理的U251细胞在不同时间点Trx和Caspase-9的表达。采用Western blotting方法检测在As₂O₃诱导的细胞凋亡中Trx和Bcl-2表达变化。（2）将Trx干扰质粒:TXN-69,TXN-107,TXN-130,TXN-213和阴性对照质粒转染入U251细胞,然后采用RT-PCR,Western blotting分别检测Trx的mRNA和蛋白水平表达情况,筛选出有效干扰质粒。（3）将筛选出的干扰质粒转染U251,以5μmol/L As₂O₃处理,设四组:转染阴性对照质粒组,转染Trx干扰质粒组,转染阴性对照质粒组+5μmol/L As₂O₃组,转染Trx干扰质粒+5μmol/L As₂O₃组。采用Annexin V-PE/7-AAD染色,流式细胞仪检测RNA干扰Trx基因表达对As₂O₃诱导的U251的凋亡的影响。结果:（1） MTT结果显示,细胞活力明显降低,呈现As₂O₃时间依赖性,12 h后显示较强的细胞毒性反应;Hoechst 33242染核后荧光显微镜观察表明,As₂O₃处理12 h之后,部分细胞核出现明显的凋亡特征如呈波纹状改变,部分染色质出现浓缩凝聚、边缘化,甚至细胞核裂解为碎块;随着时间的延长,凋亡细胞的比例明显升高;免疫细胞化学结果显示,Trx及Caspase-9的阳性细胞率也明显增加,Western blotting结果显示,Trx表达水平显著增高,Bcl-2没有明显变化。（2）荧光显微镜观察,质粒成功转入U251细胞;RT-PCR、Western blotting结果显示,干扰质粒能不同程度下调Trx mRNA水平及其蛋白表达,其中干扰质粒TXN-107作用效果最为显著。（3）流式细胞仪检测结果显示,转染TXN-107组与转染阴性质粒组相比,细胞凋亡没有明显差异;但转染TXN-107+5μmol/L As₂O₃ （16 h）组与转染阴性质粒+5μmol/L As₂O₃ （16 h）组相比,U251细胞凋亡明显增加。结论:（1） As₂O₃能够抑制U251细胞活性,并促进其凋亡,均呈时间依赖性。免疫细胞化学和Western blotting结果发现Trx和Caspase-9参与As₂O₃诱导的U251细胞凋亡过程,Bcl-2可能不参与As₂O₃介导的U251细胞凋亡。（2）成功地筛选出Trx mRNA干扰质粒。（3） Trx mRNA干扰不能明显促进U251细胞凋亡,但明显增强U251细胞对As₂O₃诱导的凋亡的敏感性。

RNA干扰抑制硫氧还蛋白基因增强人脑胶质瘤U251对三氧化二砷敏感性的研究

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