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加热致人睾丸生精障碍的蛋白质组学研究

作　者: 谢金
导　师: 周作民；沙家豪
学　校: 南京医科大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎
关键词: 蛋白质组学人睾丸加热生精障碍凋亡
分类号: R698.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

人们一直致力于男性避孕方法的开发,而睾丸局部受热导致可逆性生精障碍可能是一种候选的男性避孕途径。本实验室前期对受试者进行每天43°C水浴30分钟,连续6天的阴囊局部加热,精液检测显示加热后3周精子数开始下降,6周降至最低;加热后9周精子数开始升高,12周回复至加热前水平。睾丸组织学检查显示,加热后2周生精细胞排列紊乱,大量细胞变性脱落;加热后9周时,生精上皮的形态和结构基本恢复正常。本研究中,我们运用蛋白质组学方法对睾丸局部受热致可逆性生精障碍的分子机制进行探讨,利用双向凝胶电泳对正常人睾丸、加热后2周的睾丸、加热后9周的睾丸蛋白进行了分离,在硝酸银染色后,比对、切取加热后不同时间点发生改变的蛋白质(加热后2周/未加热,加热后9周/未加热),经胰蛋白酶消化以后用MALDI-TOF/TOF质谱仪进行鉴定,成功鉴定了55个差异蛋白点,对应于IPI数据库中的50种蛋白质。我们首先利用生物信息学方法对筛选到的全体热作用相关蛋白质进行了分析,以期从整体水平上阐明热作用致精子发生障碍的分子机制。GeneOntology分析蛋白质分子功能显示,这些差异蛋白主要属于调控蛋白及各种酶类,它们能结合蛋白质和核苷酸,或者具有水解酶及氧化还原酶的活性;其中具有氧化还原酶活性的蛋白有8个,占到了有注释蛋白质的16%。随后又对这些差异蛋白质按生物学进程进行分析,显示绝大多数的蛋白质(80%)在细胞进程中发挥了一定作用,它们或者直接参与细胞进程,或者调控细胞进程。PathwayAssist软件用来对蛋白质参与的细胞事件进行分析,结果显示这些热作用相关的蛋白质主要参与调控细胞凋亡、增殖、存活等事件。进而我们对加热后2周时睾丸与正常、加热后9周时睾丸与正常差异表达的蛋白质分别进行分析,以期能阐明2周时生精障碍以及9周时生精恢复背后的分子通路,并从中找到关键的相关蛋白。加热后2周与未加热睾丸相比共鉴定差异蛋白31种,13种升高,19种下降。Pathway分析显示差异蛋白主要参与细胞凋亡、增殖/存活事件(19/34,56%),其中ERP57、PRPF19、STCH、Ppia、LaminA、Taldo1、hspa4l等蛋白是关键蛋白,参与大多数事件,包括增殖、凋亡、存活。其中Ppia、LaminA、Taldo1表达升高,它们的作用主要是促凋亡,抗增殖/存活;ERP57、PRPF19、STCH、hspa4l表达下降,它们的作用主要是促增殖/存活,抗凋亡。加热后9周与未加热睾丸相比共鉴定差异蛋白27种,20种升高,7种下降。Pathway分析显示差异蛋白主要参与细胞凋亡、增殖、存活事件(14/27,52%),其中TCP1、RBP1、Alad、Vimentin、GAPDH、NPM、Vinculin等蛋白是关键蛋白,参与大多数事件,包括增殖、凋亡、存活。其中TCP1、RBP1、Alad、Vimentin、GAPDH蛋白表达升高,它们的作用主要是促凋亡,抗增殖/存活;NPM、Vinculin蛋白表达下降,它们的作用主要是促增殖/存活,抗凋亡。选择关键的差异蛋白,Western验证了它们的表达趋势与2D结果一致。进而对这些蛋白在人睾丸组织中的细胞定位和表达情况进行研究,结果显示它们在生精细胞和/或在Sertoli,Leydig细胞中有表达,提示直接或间接调控生精细胞增殖、凋亡。综上所述,本研究分析讨论了加热致生精障碍背后复杂的蛋白调控网络,同时找到了热作用于人睾丸的关键靶点,从而为男性避孕和男性不育的诊断治疗提供新的分子靶标。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
前言  9-12
实验材料与方法  12-27
  一、实验材料  12-15
  二、实验方法与步骤  15-27
实验结果  27-48
  一、2-DE 分离睾丸组织总蛋白及图像分析  27-35
  二、差异表达蛋白质的生物信息学分析  35-40
  三、部分差异蛋白的研究  40-48
分析与讨论  48-53
参考文献  53-57
综述：男性可逆性避孕和节育的新技术  57-83
  参考文献  77-83
攻读学位期间发表文章及待发表文章  83-84
致谢  84-85

加热致人睾丸生精障碍的蛋白质组学研究

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