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抗人DR5单抗诱导Jurkat和U937细胞凋亡机制研究

作　者: 蔡静
导　师: 李淑莲；马远方
学　校: 河南大学
专　业: 免疫学
关键词: 抗人DR5单克隆抗体(mDRA-6) 白血病细胞凋亡
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-indueing ligand,TRAIL)发现于1995年,是肿瘤坏死因子超家族的一员,它因能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡而对大多数正常细胞没有毒性而备受人们的关注。TRAIL的生物学效应是通过与细胞膜上的相应受体结合启动内源和外源性信号传导途径而产生的。DR4(TRAIL-R1)和DR5(TRAIL-R2)是TRAIL的死亡受体,其与TRAIL结合能够传导凋亡信号,诱导肿瘤细胞凋亡。虽然TRAIL有良好的抗肿瘤作用,但研究发现某些版本的rTRAIL对正常肝细胞有毒性作用,使人们对其生物安全性产生了怀疑。研究发现一些抗DR4和DR5的单克隆抗体(mAb)能够模拟TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的作用且无肝细胞毒性,因此研制抗人DR4和DR5的功能性单克隆抗体(mAb)成为TRAIL肿瘤生物治疗的有效替代品,此类的单抗已初步显示出了在癌症治疗方面的潜力。我们在实验中筛选出了一个新的小鼠抗人DR5单抗mDRA-6,该抗体在体外无交联剂的条件下能够诱导多种肿瘤细胞凋亡,而且表现出很好的体内肿瘤杀伤活性。目的探讨抗人DR5单抗mDRA-6诱导Jurkat和U937细胞凋亡机制。方法琼脂糖凝胶电泳检测Jurkat和U937细胞DNA的片段化降解;MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪定量分析技术检测细胞凋亡;免疫印迹技术(Western blotting)检测细胞相关凋亡蛋白的激活情况;免疫沉淀法和银染法检测细胞DISC复合物:RT-PCR法检测Jurkat和U937细胞DR5、Caspase-8和Caspase-10 mRNA的表达情况。结果1.10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞6h后,琼脂糖凝胶电泳显示DNA片段化降解,表现为梯形DNA电泳条带,预先用Caspase抑制剂干预后mDRA-6作用Jurkat和U937细胞,无明显DNA梯形电泳条带显示。2.MTT结果表明,10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞2h后凋亡率分别为59.97%和42.38%;应用Caspase-8和Caspase-10抑制剂干预后,mDRA-6致Jurkat细胞死亡率分别降低45.32%(P＜0.05)和4.52%(P＞0.05);mDRA-6致U937细胞死亡率分别降低4.33%(P＞0.05)和30.36%(P＜0.05)。3.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞2h,细胞凋亡率分别为62.62%和35.65%;预先用广谱Caspase-8抑制剂、Caspase-10抑制剂、Caspase-9抑制剂和Caspase抑制剂Z-VAD-FMK干预,mDRA-6致Jurkat细胞凋亡率分别减少45.87%、4.33%、46.44%和42.75%,mDRA-6致U937细胞凋亡率分别减少0.89%、11.67%、2.33%和1.57%。预先用JNK抑制剂和NF-κB抑制剂干预,mDRA-6致Jurkat细胞凋亡率分别增加10.63%和5.14%,mDRA-6致U937细胞凋亡率分别增加26.67%和21.1%。4.免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用Jurkat和U937细胞不同时间后提蛋白,Jurkat和U937细胞Caspase-3、-9、PARP、P-38、Bax、Bcl-2、Bcl—xL均有激活表现:而Caspase-8仅在Jurkat细胞有激活显示,Caspase-10仅在U937细胞有激活显示;Caspase全抑制剂干预后,Jurkat和U937细胞Caspase-3、-9及PARP的激活片段被抑制;此外Jurkat和U937细胞于mDRA-6作用5min后JNK呈现活性片段表达,并随mDRA-6作用时间的延长其活性增强;Caspase全抑制剂干预后,mDRA-6作用5min、15minJNK磷酸化增强,但随mDRA-6作用时间的延长,JNK磷酸化逐渐减弱。5.免疫沉淀法结果显示,与裸细胞组相比较,mDRA-6作用U937细胞后有Caspase-10的特异条带出现,而mDRA-6作用Jurkat细胞后没有Caspase-10的特异条带出现。6.RT-PCR法检测发现,U937细胞Caspase-10 mRNA表达高于Jurkat细胞,而Jurkat和U937细胞DR5和Caspase-8 mRNA表达无明显差异。结论1.mDRA-6能够诱导人白血病Jurkat和U937细胞凋亡,其机制是主要激活死亡受体信号传导途径;Jurkat激活起始Caspase-8诱导细胞凋亡,U937细胞激活起始Caspase-10诱导细胞凋亡。Jurkat和U937细胞通过不同的起始Caspase诱导凋亡,可能与U937细胞Caspase-10 mRNA表达明显高于Jurkat细胞有关。2.mDRA-6诱导白血病细胞凋亡过程中有JNK和NF-κB的激活并且其发挥抗凋亡作用,应用JNK和NF-κB抑制剂能有效增强mDRA-6的凋亡诱导作用。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-12
1 引言  12-14
2 材料、试剂与仪器  14-21
  2.1 材料与试剂  14-20
    2.1.1 细胞系及细胞培养的试剂  14-15
    2.1.2 提取DNA及检测细胞凋亡主要试剂  15
    2.1.3 细胞免疫印迹主要试剂  15-17
    2.1.4 免疫沉淀主要试剂  17-18
    2.1.5 银染主要试剂  18-19
    2.1.6 核酸提取扩增主要试剂  19-20
  2.2 主要仪器设备  20-21
3 实验方法及步骤  21-32
  3.1 细胞培养  21
  3.2 DNA ladder检测细胞凋亡  21-22
  3.3 mDRA-6细胞毒性测定(MTT法)  22
  3.4 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况  22-23
  3.5 细胞总蛋白的提取  23
  3.6 总蛋白定量(BCA法)  23-24
  3.7 蛋白质凝胶电泳  24-25
  3.8 Western blotting蛋白转印  25-27
  3.9 免疫沉淀法分析DISC复合物的形成  27-28
  3.10 银染分析DISC复合物  28-29
  3.11 荧光定量PCR  29-31
    3.11.1 细胞总RNA提取  29
    3.11.2 RT-PCR  29-30
    3.11.3 PCR产物的纯化  30-31
    3.11.4 PCR产物的定量分析  31
  3.12 统计学分析  31-32
4 实验结果  32-42
  4.1 DNA ladder检测细胞凋亡  32
  4.2 MTT检测细胞生长抑制率  32-33
  4.3 流式细胞术检测细胞凋亡结果  33-36
  4.4 蛋白标准曲线  36
  4.5 Western blot  36-38
  4.6 免疫沉淀法分析DISC复合物的形成  38-39
  4.7 银染分析DISC复合物的形成  39
  4.8 荧光定量PCR  39-42
    4.8.1 RNA纯度分析及含量测定  39-40
    4.8.2 RT-PCR  40
    4.8.3 PCR产物的定量分析  40-42
5 讨论  42-46
结论  46-47
参考文献  47-50
文献综述  50-69
附录  69-71
致谢  71

抗人DR5单抗诱导Jurkat和U937细胞凋亡机制研究

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