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YC－1对食管鳞癌细胞Eca109缺氧诱导因子-1α表达的抑制作用

作　者: 冯亚东
导　师: 施瑞华
学　校: 南京医科大学
专　业: 消化内科
关键词: 食管肿瘤 缺氧诱导因子-1α YC-1 增殖 凋亡
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景:食管癌是我国常见的恶性肿瘤,发病率和死亡率均处于前列,主要病理类型为食管鳞癌,约占全部食管癌的95%左右。近年来大量研究表明,缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)作为重要的转录因子与食管癌的发生发展中重要作用,是机体适应缺氧微环境的关键调节因子,与肿瘤血管生成、转移和浸润密切相关。HIF-1α已经成为肿瘤发病机制和治疗研究方面的热点之一,针对HIF-1α这一靶点进行抗肿瘤药物的开发,对于治疗食管癌具有重要意义。YC-1 [3-(5’-hydroxymethyl-2’-furyl)-1-benzylindazole]在肝癌、肺癌、肾癌等恶性肿瘤中抑制HIF-1α及其下游基因的表达,能有效抑制肿瘤血管生成,降低肿瘤血管密度,抑制肿瘤细胞增殖,显示出良好的抗肿瘤活性。目的:应用YC-1作用于食管鳞癌Eca109细胞株,研究YC-1对Eca109细胞HIF-1α表达的效应和可能的机制,观察YC-1对Eca109细胞增殖、凋亡和侵袭性等方面的影响。方法:1.食管鳞癌细胞Eca109物理缺氧培养不同时间(0、24、48、72h),以Westernblot法检测细胞中HIF-1α蛋白的表达变化,选择可以引起HIF-1α蛋白表达最高的时间点作为缺氧培养时间。2.不同浓度的YC-1(0、1、5、10、20、30、40μmol/l)作用于食管鳞癌细胞Eca109不同时间(24、48、72h),MTT法检测细胞的增殖,计算YC-1抑制Eca109细胞的IC50。3. Eca109细胞分别常氧培养及缺氧培养,加入终浓度为0、20μmol/l的YC-1培养48h,以Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α和MAPKp42/p44蛋白及mRNA表达,同时Western blot检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、p53、Survivin、Bcl2、Bax的表达。4.取对数生长期的Eca109细胞1×105加入Transwell培养皿上室,下室加入终浓度为为0、20μmol/l的YC-1培养分别常氧缺氧24h,计算迁徙细胞数。5.Eca109细胞分别常氧培养及缺氧培养,加入终浓度为0、20μmol/l的YC-1培养48h,用AnnexinⅤ-PI细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。6.Eca109细胞加入终浓度为0、20μmol/l的YC-1培养24、48、72h,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:1.缺氧条件下HIF-1α蛋白在食管鳞癌细胞Eca109中的表达常氧状态下,在Eca109细胞中存在HIF-1α蛋白的表达,物理缺氧培养48小时HIF-1α表达最强,选取48小时为后续实验的缺氧时间。2.YC-1对食管鳞癌细胞Eca109增殖的影响不同浓度YC-1作用于Eca109细胞,均能够抑制其增殖,效应呈剂量时间依赖方式。YC-1与Eca109细胞共培养48小时,IC50为20μmol/l,选取该浓度作为后续实验YC-1的药物浓度。3.YC-1对食管鳞癌细胞Eca109HIF-1α和相关基因表达的影响RT-PCR和Western blot检测显示YC-1抑制HIF-1α和MAPKp42/p44 mRNA和蛋白的表达。YC-1抑制VEGF、MMP2、Survivin、Bcl2的表达,上调p53、Bax的表达。4.YC-1对食管鳞癌细胞Eca109迁移的影响YC-1作用于Eca109细胞,穿膜细胞数明显减少,提示YC-1对Eca109细胞迁移有抑制效应。常氧和缺氧培养穿膜细胞数无统计学差异,说明缺氧对Eca109细胞迁移无明显影响。5.YC-1对食管鳞癌细胞Eca109细胞凋亡的影响Eca109细胞缺氧培养时细胞凋亡率较常氧培养增高,YC-1提高细胞凋亡率。20μmol/l YC-1作用于Eca109细胞缺氧培养48小时细胞凋亡率最高,各组之间有统计学差异。6.YC-1对食管鳞癌细胞Eca109细胞周期的影响YC-1诱导Eca109细胞出现S期阻滞,20μmol/l YC-1与Eca109细胞培养24、48、72小时,S期比例逐渐上升,差异有统计学意义。结论:1. YC-1抑制Eca109细胞的增殖和迁移,促进Eca109细胞的凋亡,使Eca109细胞发生S期阻滞。2.YC-1抑制常氧和缺氧时Eca109细胞HIF-1αmRNA和蛋白的表达,提示YC-1对HIF-1α表达的抑制作用发生在基因水平。3.YC-1可能通过抑制HIF-1α的表达减少VEGF、MMP2的表达,进而抑制肿瘤血管生成和抑制侵袭转移从而影响肿瘤的生长。4.YC-1对Eca109细胞MAPKp42/p44 mRNA和蛋白的表达有抑制作用,提示可能通过MAPKp42/p44抑制HIF-1α的表达。

全文目录


一、英文缩略词表  4-5
二、中文摘要  5-8
三、英文摘要  8-12
四、论文正文  12-37
  引言  12-13
  材料和方法  13-23
  结果  23-32
  讨论  32-36
  小结  36-37
五、参考文献  37-43
六、综述  43-53
  参考文献  48-53
七、文章发表情况  53-54
八、致谢  54

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 食管肿瘤
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