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C2-神经酰胺诱导的牛晶状体上皮细胞的凋亡

作　者: 张岩
导　师: 张凤妍
学　校: 郑州大学
专　业: 眼科学
关键词: C2-神经酰胺 晶状体上皮细胞 凋亡 半胱天冬酶-3
分类号: R776.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


背景与目的白内障是目前全球范围内致盲的主要原因,其发病机制一直是国内外学者关注的问题。有研究发现晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）的凋亡是导致晶状体混浊,引起白内障形成的一个重要原因。鞘磷脂是维持细胞膜结构的重要组成部分,经鞘磷脂酶作用后的产物神经酰胺在诱导细胞凋亡的信号转导过程中具有决定性作用,是衡量细胞凋亡的重要特征性标志之一。神经酰胺不仅与血液系统、神经系统以及消化系统肿瘤的发生发展有关,而且与其他非肿瘤性疾病的发生也密切相关。鞘磷脂是晶状体膜主要的脂质成分,在晶状体上皮、皮质和核的区域,已经有鞘磷脂酶活性的报道。而且,有学者曾报道白内障患者晶状体中神经酰胺的浓度是相同年龄正常晶状体的四倍。然而,鞘磷脂代谢产物神经酰胺在正常LECs中及在白内障的发展过程中的作用还不十分清楚。半胱天冬酶-3（cysteine-requiring aspartate protease-3,caspase-3）是一种凋亡执行蛋白酶,位于caspase凋亡级联“瀑布”下游,在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。已有报道神经酰胺可以诱导caspase依赖性和caspase非依赖性的细胞凋亡。本实验研究外源性C2-神经酰胺对培养的牛晶状体上皮细胞存活和凋亡的影响;并观察在此过程中,牛晶状体上皮细胞中是否存在caspase-3活性的变化。方法1.C2-神经酰胺的配制C2-神经酰胺粉剂用无水乙醇配制成400mmol/L储备液,-20℃保存。给药时,用DMEM培养液稀释无水乙醇至终体积分数≤0.1%。2.牛LECs的原代和传代培养新鲜牛眼从郑州屠宰场获得。无菌条件下取出晶状体,截取晶状体前囊,放入含20%胎牛血清的DMEM培养液中。将前囊剪成约1mm×1mm大小的碎片,均匀分种于25ml培养瓶中培养,每2-3天更换培养液。原代培养的细胞在培养瓶中长满融合,用2.5g/L胰蛋白酶消化后,按1:2比例传代,传代后每3天更换培养液。3.MTT法测定C2-神经酰胺对牛LECs增殖的影响浓度为1×105/ml的牛LECs经不同浓度（50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L）C2-神经酰胺作用24h,MTT法测量570nm波长OD值,计算细胞抑制率。抑制率=（对照组OD值—实验组OD值）/对照组OD值×100%4.TUNEL染色检测牛LECs的凋亡浓度为1×105/ml的牛LECs经不同浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）C2-神经酰胺作用12h,按照一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明操作,荧光显微镜下每种浓度随机选取5个100倍视野并采集图像,用Image-Pro Plus5.0图像分析软件进行分析,计算积分光密度,反应细胞凋亡情况。5.Caspase-3活性的测定预先将pNA（10mM）稀释为200μmol/L,作为标准品。牛LECs经不同浓度（25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）C2-神经酰胺作用后,加入裂解液冰浴裂解,并离心收集上清液。按caspase-3活性检测试剂盒说明操作,于405nm波长检测OD值,计算caspase-3激活率。caspase-3激活率=（实验组和对照组OD值/阳性对照组OD值）×100%。6.统计学分析用SPSS13.0统计软件进行统计分析。数据以（?）±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用q检验。以a=0.05为检验水准。结果1.培养的牛LECs形态学观察原代牛LECs在接种后24-48h即可见上皮细胞从囊膜组织块周边长出,随后几天,细胞围绕囊膜组织块向外生长,原代细胞从组织块长出时呈多角形、长梭形,细胞透亮,大小不一。随着细胞不断分裂,细胞呈单层生长。约15-18天细胞生长达融合状态。经胰蛋白酶消化后,传代培养的细胞为圆形,12h内完全贴壁并开始迅速增殖,约6-8天长满融合,细胞形态与原代无明显差别。2.细胞抑制率的测定结果C2-神经酰胺对牛LECs的半数抑制浓度(IC50)位于50μmol/L～100μmol/L的浓度区间内,因此选择100μmol/L为随后实验的浓度上限。作用时间达12h时,细胞抑制率下降显著,因此选取12h作为随后实验的时间上限。3.细胞凋亡的测定结果TUNEL荧光染色后,凋亡细胞被标记绿色荧光。随着C2-神经酰胺浓度的增加,凋亡细胞的积分光密度也随之增大（P＜0.01）,C2-神经酰胺诱导的牛LECs的凋亡呈剂量依赖关系。4.Caspase-3活性的测定结果随着C2-神经酰胺浓度的增加,细胞凋亡蛋白酶caspase-3激活率也随之增加,具有统计学意义（P＜0.01）。结论1.C2-神经酰胺能抑制牛LECs的生长。2.C2-神经酰胺可以诱导牛LECs发生凋亡,并且呈一定的剂量依赖关系。3.在C2-神经酰胺诱导牛LECs凋亡的过程中,存在细胞凋亡蛋白酶caspase-3活性的表达。

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中图分类: > 医药、卫生 > 眼科学 > 晶状体与玻璃体疾病 > 白内障
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