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全反式视黄酸对兔视网膜色素上皮细胞的影响

作　者: 王媛
导　师: 张金嵩；张效房
学　校: 郑州大学
专　业: 眼科学
关键词: 近视全反式视黄酸视网膜色素上皮细胞肝细胞生长因子基质金属蛋白酶-2
分类号: R774.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的近视眼是眼科的常见病、多发病,影响患者的工作、学习和生活,发病率逐年上升,已成为全球性社会问题。对于近视的研究已有200多年的历史,但其发病机制尚无定论。因此,阐明近视的发病机制日益成为生命科学领域急需解决的一大难题。20世纪后30年内近视的动物实验研究取得了巨大进展,确立了两种近视的动物实验模型,即:形觉剥夺性近视（form deprivation myopia,FDM）,指用缝合眼睑或戴弥散镜片严重破坏动物的形体觉所引起的近视。离焦性近视（defocus myopia）,指强迫动物视近或戴负球镜片使物体聚焦于视网膜后方,从而引起调节和眼轴延长,以致造成近视。自建立动物近视模型以来,人们对近视的发生、发展及转归有了更深入的研究。研究中发现诱导近视发生的物质主要来自视网膜神经上皮。视网膜神经上皮产生的一级信使首先作用于视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞和葡萄膜细胞,使之产生的下一级生化物质（称为二级信使）,再作用于巩膜,调控巩膜生长,导致巩膜重塑,眼轴延长。一些自分泌或旁分泌环路涉及的细胞因子、生长因子及其酪氨酸激酶受体可能对RPE细胞的病理改变起重要作用。全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,ATRA）是维生素A的衍生物,能有效的调节细胞分化和发育。ATRA具有致畸性,并且是眼球发育的重要因子。研究表明,ATRA对于视网膜、巩膜的发育及特定细胞类型（如感受器细胞、无长突细胞）的分化和成熟具有重要的影响。已知视网膜内层的无长突细胞参与了ATRA的代谢,而视网膜无长突细胞位于视网膜图像加工过程的输出端,这种加工过程的输出与视觉控制眼球生长有关。近年来研究表明,ATRA对RPE细胞的增生有抑制作用,类似近视眼病理改变。在已知的近视信使中bFGF与TGF-β近年来研究较为深入,然而能影响眼球生长的肝细胞生长因子（hepatocytegrowth factor,HGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）则研究较少。本研究拟建立RPE细胞近视模型,从细胞的微观角度来定性定量观察ATRA在体外诱导RPE细胞在近视改变中的作用,应用免疫细胞化学法测定RPE细胞内HGF、MMP-2的表达,用ELISA法测定RPE细胞中HGF的分泌量,以探讨ATRA抑制RPE细胞的机制,以及在此作用下近视相关因子HGF、MMP-2的变化情况及关系。材料与方法1.选取健康1周龄黑色家兔12只,麻醉后在无菌条件下取双眼球,距角膜缘后2mm环形剪开并去除眼前段组织及玻璃体,将眼后段制成眼杯并固定,用0.25%Trypsin+0.02%EDTA约2ml室温消化3min,吸出消化下来的神经上皮层,再加入胰蛋白酶于37℃、5%CO₂的培养箱消化15min,加入含FBS的DMEM终止消化,吸管轻轻吹打使RPE细胞脱落,收集细胞悬液于离心管中离心5min,加入含20%FBS的DMEM接种于培养瓶中,于细胞培养箱中原代培养。以此法传代至第3-5代可用于实验研究。2.应用波形蛋白和角蛋白多克隆抗体,免疫细胞化学染色法鉴定RPE细胞。3.在RPE细胞生长的不同时间点（24h、48h、72h）,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA,应用台盼蓝排斥实验测定ATRA作用后的RPE细胞生存率。4.在RPE细胞生长的不同时间点,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml浓度的ATRA,应用免疫细胞化学染色法测定RPE细胞内近视相关因子HGF、MMP-2的表达。5.在RPE细胞生长的不同时间点,加入5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml浓度的ATRA,应用酶联免疫吸附试验法测定RPE细胞中HGF分泌量。6.采用SPSS 10.0统计学软件进行统计学分析,测试指标数据用（?）±s表示,不同浓度ARTA组在各处理时间点的RPE细胞活力比较采用x²检验。对不同时间和不同ARTA浓度组的RPE细胞分泌HGF量的比较采用两因素方差分析,各时间点间和各浓度组间的多重比较采用LSD-t检验。以α=0.05作为检验水准。结果1.成功建立RPE细胞培养模型,观察正常RPE细胞形态学特征:RPE细胞呈椭圆形或不规则多角形,常可看到白色透明的胞核核仁,细胞质内布满丰富的黑色素颗粒,环绕细胞核以同心圆状分布。2.ATRA作用后RPE细胞形态学特征:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA均能抑制RPE细胞的增生,细胞增大扁平,突起减少,色素弥散。不同浓度的ATRA作用24h、48h、72h后RPE细胞均有增大扁平,突起减少,部分裂解,活力减弱的表现。3.台盼蓝排斥实验提示:5nM/ml、10nM/ml、20nM/ml的ATRA作用24h后细胞存活率分别为99.50%、91.67%和87.44%（x²=10.80,P=0.002）;48h后细胞存活率分别为99.02%、88.17%和80.44%（x²=18.59,P＜0.001）;72h后细胞存活率分别为98.44%、86.94%和71.08%（x²=29.46,P＜0.001）。4.免疫细胞化学染色法检测HGF和MMP-2的表达提示:RPE细胞中HGF、MMP-2的阳性表达位于RPE细胞的细胞质中,阳性表达随ATRA的浓度增高而增加,随ATRA作用时间延长亦增加。在相同浓度和作用时间HGF的阳性表达比MMP-2的阳性表达更明显。5.ELISA检测HGF分泌量提示:RPE细胞分泌HGF的量随ATRA的浓度增高而增加,任意两组比较均有P＜0.05。ARTA作用时间长短对RPE细胞分泌HGF的量影响不大,任意两组比较均有P＞0.05。结论1.ATRA的浓度≥5 nmol/mL可引起RPE细胞的生长抑制,存活率降低,类似于近视眼RPE细胞改变。2.ATRA作用下RPE细胞中HGF、MMP-2表达增加,且HGF的增加更明显。

全文目录

摘要  3-7
Abstract  7-12
论文部分全反式视黄酸对兔视网膜色素上皮细胞的影响  12-39
  引言  12-14
  材料与方法  14-20
  结果  20-23
  讨论  23-30
  结论  30-31
  附图  31-33
  参考文献  33-39
综述肝细胞生长因子及其受体与眼部疾病  39-49
  正文  39-45
  参考文献  45-49
英文缩略词索引  49-50
攻读硕士期间发表论文情况  50-51
致谢  51

全反式视黄酸对兔视网膜色素上皮细胞的影响

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