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紫花苜蓿再生体系的建立及根癌农杆菌介导聚磷基因ppk的遗传转化

作　者: 施莉娟
导　师: 蒲小鹏；许雷
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 草业科学
关键词: 苜蓿再生体系根癌农杆菌转化
分类号: S541.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

世界范围内,磷肥的有效利用率普遍偏低,牧草缺磷是严重限制苜蓿生产品质和生态、经济效益的主要因素,本研究旨在将多聚磷基因ppk转进紫花苜蓿,育成聚磷植物以减少苜蓿种植区的土壤磷肥施用量,提高磷肥有效利用率,同时可在农田和水体交界处建立苜蓿缓冲带,控制水体富营养化。本文通过对2个紫花苜蓿品种再生系统的建立和比较,选择最佳的遗传转化受体及其再生系统,利用根癌农杆菌介导法将聚磷基因ppk转入紫花苜蓿,初步得到了Kan抗性植株。主要研究内容如下:1新疆大叶紫花苜蓿再生体系在流水下冲洗一个小时后用70%的酒精处理50秒,再用10%的次氯酸钠震荡处理22min,是本实验中较为理想的灭菌方法;新疆大叶最适宜的外植体是4周龄无菌苗的叶片;愈伤诱导培养基为:MS+ 2,4-D(2.0 mg/L) + KT (0.5 mg/L );芽分化培养基为:MS+ 6-BA(0.5 mg/L)+ NAA( 0.05 mg/L);2保定苜蓿再生体系保定苜蓿最适宜诱导分化的外植体为无菌种子萌发6天的下胚轴;愈伤组织诱导阶段最佳培养基为:SH+ 2,4-D(2.0mg/L)+KT(0.05mg/L);最佳的芽分化培养基为:SH+KT(0.4mg/L)+NAA(0.3 mg/L);3转化受体的选择新疆大叶苜蓿的再生频率(156.76%)高于保定苜蓿(117.03%)。选择新疆大叶作为遗传转化受体。4遗传转化体系的建立以新疆大叶紫花苜蓿的无菌苗叶片为外植体,以农杆菌菌株LBA4404为介体,优化的基因转化体系如下:Kan筛选浓度定为25~50mg/L;抑菌剂选取羧苄青霉素为宜,抑菌浓度为500mg/L;用于转化的侵染时间为15 min,菌液浓度OD600=0.5,与农杆菌共培养3d。经筛选,得到11株抗Kan转化植株。经PCR检测其中2株表现为阳性。

全文目录

主要英文缩略词表  3-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
前言  11-12
第一章文献综述  12-28
  1 紫花苜蓿再生体系研究进展  12-17
    1.1 苜蓿再生体系的构建方法  12-13
      1.1.1 愈伤组织再生途径  12-13
      1.1.2 原生质体再生途径  13
      1.1.3 胚状体再生途径  13
    1.2 基本培养基的选择  13-14
    1.3 外植体的选择  14-15
    1.4 激素配比  15-16
      1.4.1 愈伤组织的诱导  15-16
      1.4.2 愈伤组织的分化  16
    1.5 紫花苜蓿再生体系建立存在的问题  16-17
    1.6 紫花苜蓿再生体系建立的发展局势和应用前景  17
  2 苜蓿基因工程的研究进展  17-25
    2.1 苜蓿转化的方法  17-20
      2.1.1 农杆菌介导法  17-19
      2.1.2 基因枪法  19
      2.1.3 电激法  19-20
      2.1.4 显微注射法  20
    2.2 转基因苜蓿的研究进展  20-23
      2.2.1 转基因抗寒抗旱苜蓿  20
      2.2.2 转基因抗除草剂苜蓿  20-21
      2.2.3 转耐盐碱基因苜蓿  21
      2.2.4 转抗病毒基因苜蓿  21-22
      2.2.5 转抗病虫害基因苜蓿  22-23
    2.3 转基因苜蓿品质改良  23-24
      2.3.1 提高苜蓿含硫氨基酸的含量  23
      2.3.2 提高苜蓿的消化率  23-24
    2.4 基因工程在苜蓿其他方面的应用  24
      2.4.1 分子标记技术  24
      2.4.2 作为生物反应器  24
    2.5 苜蓿遗传转化存在的问题  24
    2.6 转基因苜蓿的发展局势和应用前景  24-25
  3 聚磷酶基因ppk 的意义及应用  25-28
    3.1 磷肥对紫花苜蓿生长发育和产量、品质的影响  25
    3.2 湖泊水体富营养化  25-26
    3.3 聚磷酶  26-27
    3.4 聚磷酶ppk 植物基因工程  27-28
第二章不同品种苜蓿再生体系的建立  28-48
  1 新疆大叶紫花苜蓿再生体系的建立  28-40
    1.1 材料与方法  28-32
      1.1.1 试验材料  28
      1.1.2 主要设备  28
      1.1.3 试验方法  28-32
    1.2 结果与分析  32-38
      1.2.1 种子脱毒  32-33
      1.2.2 不同部位外植体对愈伤诱导的影响  33-34
      1.2.3 不同激素及其组合对新疆大叶紫花苜蓿愈伤组织诱导的影响  34-36
      1.2.4 愈伤组织的分化培养  36-38
    1.3 讨论  38-39
      1.3.1 不同的外源生长调节物质对苜蓿植株再生的影响  38-39
      1.3.2 褐化的产生  39
    1.4 小结  39-40
  2 保定苜蓿再生体系的建立  40-46
    2.1 材料和方法  40-42
      2.1.1 试验材料  40
        2.1.1.1 植物材料  40
        2.1.1.2 基本培养基成分  40
      2.1.2 试验方法  40-42
    2.2 结果与分析  42-45
      2.2.1 外植体的选择对愈伤组织的影响  42
      2.2.2 愈伤组织的诱导  42-44
      2.2.3 分化的诱导  44-45
    2.3 讨论  45-46
      2.3.1 外植体再生能力  45
      2.3.2 不同品种紫花苜蓿植株再生能力的差异  45-46
      2.3.3 玻璃苗问题  46
    2.4 小结  46
  3 两种苜蓿再生能力的比较  46-48
第三章农杆菌介导的ppk 基因对紫花苜蓿的转化研究  48-60
  1 材料和方法  48-54
    1.1 材料  48-49
      1.1.1 植物材料  48
      1.1.2 试验设备  48
      1.1.3 质粒和农杆菌菌株  48
      1.1.4 培养基  48-49
      1.1.5 抗生素  49
    1.2 试验方法  49-54
      1.2.1 菌种的活化和检验  49-51
      1.2.2 叶盘法转化苜蓿  51-52
      1.2.3 农杆菌介导的遗传转化条件  52
      1.2.4 抗性植株电泳检测  52-54
  2 结果与分析  54-58
    2.1 Carb 对农杆菌抑菌效果的确定  54
    2.2 Kan 对紫花苜蓿愈伤组织生长的影响  54-55
    2.3 侵染时菌液浓度对转化率的影响  55-56
    2.4 农杆菌侵染时间对转化率的影响  56-57
    2.5 共培养时间  57
    2.6 PCR 分子签定  57-58
  3 讨论  58-59
    3.1 乙酰丁香酮浓度对转化率的影响  58
    3.2 选择方式对转化效果的影响  58-59
  4 结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-69
附图  69-71
作者简介  71-72
导师简介  72-73

紫花苜蓿再生体系的建立及根癌农杆菌介导聚磷基因ppk的遗传转化

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