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猪GFAT1与SLC2A基因家族中6个基因克隆、定位、SNP检测及与生产性状的关联分析

作　者: 刘科
导　师: 余梅
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 GFAT1 SLC2A基因家族基因定位表达谱 SNP 关联分析
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 66次
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内容摘要

本论文根据比较基因定位信息，并结合公共数据库中的EST资源，分离猪葡萄糖代谢通路上的GFAT1基因及SLC2A基因家族中的6个基因，通过对其克隆、染色体定位、组织表达谱分析、多态位点检测及与生产性状的关联分析，为进一步研究猪胴体、生长、肉质性状打下基础，并为将来应用于分子标记辅助选择育种提供初步依据。主要研究结果如下：1．分别依据人cDNA信息获得的猪EST所构建的EST重叠群设计的猪特异引物，分离克隆了猪GFAT1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A8和SLC2A12共七个基因的基因片段，部分序列已提交GenBank数据库，获得了GenBank收录号，分别为EF011104(SLC2A2)、EF012367(SLC2A3)、EF012368(SLC2A5)、EF012369(SLC2A8)、EF012370(SLC2A12)。2．分别利用体细胞杂种板和辐射杂种板技术对其中六个基因进行了染色体定位。结合两者结果表明GFAT1基因定位在猪3q21-q27，与SW828(LOD=12.39)紧密连锁；SLC2A2基因定位在猪13q23-(1／2 q41)，与S0084紧密连锁(LOD=4.29)；SLC2A3基因定位在猪5q25，与SW963(LOD=14.46)紧密连锁；SLC2A5基因定位在猪6q22-q23，与SW1355(LOD=6.65)紧密连锁；SLC2A8基因定位在猪1q28-q213，与SW705(LOD=4.32)紧密连锁；SLC2A12基因定位在猪1p24-p25，与SW1851(LOD=6.22)紧密连锁。3．以成年长白母猪和成年通城猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、小肠、胃各9个组织及出生4天长大杂交小猪肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏6个组织作为研究材料，利用RT-PCR检测了猪GFAT1基因在上述组织的表达，结果发现，GFAT1基因在各组织均表达，但在骨骼肌和心肌中存在两个转录本。以成年通城猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、小肠、胃、各9个组织作为研究材料，利用RT-PCR检测了猪SLC2A4基因在每个组织中的表达情况，结果发现，该基因在多数组织中表达，但在骨骼肌和心肌中表达量较高。4．在GFAT1基因第8内含子中发现了MvaI—RFLP(G-A)多态位点；在SLC2A4基因第4外显子中发现了HinlI—RFLP(T-C)多态位点，该突变位点没有引起氨基酸的改变。采用PCR—RFLP分析技术，利用不同猪群进行基因型检测，结果表明，GFAT1基因在国内品种(通城猪)中呈偏态分布(G等位基因频率为0)、在大长通中具有丰富多态性；SLC2A4基因在各品种中均具有多态性。5．利用SAS8.2中的广义线性模型(GLM)程序，以本室与通城县畜牧局种畜场合作所建立的试验群体(含通城、长白、大白、长大通和大长通猪群)为研究对象，检测了GFAT1第8内含子MvaI—RFLP位点的多态性，分析该基因与部分生产性状的关联，初步研究结果显示该位点的不同基因型与胴体性状的臀中肌中点处膘厚和胴体直长显著相关(P＜0.05)；同时也分析了SLC2A4第4外显子HinlI—RFLP位点的多态性，并检测了其与部分生产性状的关联，结果显示该位点不同基因型与肉质性状中的肌肉剪切力值存在显著相关(P＜0.05)。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
1 文献综述  12-21
  1.1 猪基因组研究现状  12-13
  1.2 猪中重要生理功能相关基因研究现状与继续寻找新基因的必要性  13-15
    1.2.1 与生长和胴体性状相关的候选基因  13-14
    1.2.2 与肉质性状相关的候选基因  14
    1.2.3 猪生产性状相关候选基因进一步挖掘的必要性  14-15
  1.3 葡萄糖转运和氨基己糖路径  15-16
    1.3.1 葡萄糖转运  15-16
    1.3.2 氨基己糖通路  16
  1.4 GFAT1基因的研究进展  16-17
  1.5 SLC2A基因家族的研究进展  17-21
    1.5.1 GLUTs的分子构型  17-18
    1.5.2 GLUTs的类型  18
    1.5.3 SLC2A基因家族的定位及蛋白GLUTs的结构,分布  18-21
2 本研究的目的和意义  21-22
3 材料和方法  22-33
  3.1 材料  22-26
    3.1.1 组织样品  22
    3.1.2 DNA样品  22-23
    3.1.3 主要仪器设备  23
    3.1.4 培养基、工具酶及试剂盒  23-24
    3.1.5 主要试剂及配制  24-25
      3.1.5.1 主要试剂  24
      3.1.5.2 主要试剂配制  24-25
    3.1.6 数据库及分析软件  25-26
      3.1.6.1 常用分子生物学网站  25
      3.1.6.2 主要分子生物学软件和统计软件  25-26
  3.2 方法  26-33
    3.2.1 猪候选基因的分离方法  26-28
      3.2.1.1 猪EST信息的获取和整理  26
      3.2.1.2 引物设计  26
      3.2.1.3 总RNA提取  26
      3.2.1.4 RNA的甲醛凝胶电泳  26-27
      3.2.1.5 反转录反应(Reverse transcription RT)  27
      3.2.1.6 PCR扩增条件  27
      3.2.1.7 PCR产物的纯化、克隆和测序  27-28
      3.2.1.8 DNA序列同源性检索鉴定  28
    3.2.2 六个基因染色体定位  28-31
      3.2.2.1 引物设计  28-29
      3.2.2.2 PCR扩增分型条件  29-30
      3.2.2.3 数据分析方法  30-31
    3.2.3 利用RT-PCR进行GFAT1和SLC2A4编码区的扩增  31
    3.2.4 利用RT-PCR进行GFAT1和SLC2A4基因组织表达谱研究的方法  31-32
    3.2.5 PCR-RFLP方法检测猪GFAT1和SLC2A4基因的多态性  32
      3.2.5.1 扩增引物  32
      3.2.5.2 酶切条件  32
      3.2.5.3 基因分型  32
    3.2.6 多态标记与性状的关联分析方法  32-33
4 结果  33-55
  4.1 基因片段的分离、序列分析与鉴定结果  33-42
    4.1.1 总RNA的提取与检测结果  33
    4.1.2 分离猪GFAT1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A4、SLC2A5、SLC2A8和SLC2A12基因的结果  33-35
    4.1.3 猪GFAT1基因完整编码区(CDS)的序列分析  35-39
    4.1.4 猪SLC2A4基因完整编码区(CDS)的序列分析  39-42
  4.2 基因的定位结果  42-48
    4.2.1 利用SCHP进行染色体区域定位结果  42-45
      4.2.1.1 GFAT1基因染色体区域定位结果  42-44
      4.2.1.2 SLC2A基因家族5个基因染色体区域定位结果  44-45
    4.2.2 利用辐射杂种板RH进行精细定位结果  45-48
      4.2.2.1 GFAT1基因精细定位结果  45-46
      4.2.2.2 SLC2A基因家族5个基因精细定位结果  46-48
  4.3 RT-PCR扩增的结果  48-50
    4.3.1 GFAT1组织表达表达谱分析  48-49
    4.3.2 SLC2A4组织表达表达谱分析  49-50
  4.4 猪GFAT1和SLC2A4基因的SNP检测及其与性状的关联分析  50-55
    4.4.1 猪GFAT1基因第八内含子多态检测及与性状的关联分析  50-52
      4.4.1.1 SNP检测  50-51
      4.4.1.2 不同猪群基因型频率的检测结果  51-52
    4.4.2 猪SLC2A4基因第四外显子多态检测及与性状的关联分析  52-55
      4.4.2.1 SNP检测  52-53
      4.4.2.2 不同猪群基因型频率的检测结果  53-55
5 讨论  55-60
  5.1 关于基因的物理定位  55-57
    5.1.1 定位引物的设计  55-56
    5.1.2 基因的定位结果  56-57
  5.3 关于GFAT1和SLC2A4基因的组织表达谱  57-58
  5.4 关于基因的多态性检测及性状的关联分析  58-60
    5.4.1 GFAT1基因第八内含子的多态性  58
    5.4.2 SLC2A4基因第四外显子的多态性  58-60
6 小结  60-62
  6.1 本研究获得的结果  60
  6.2 本研究的创新点  60-61
  6.3 本研究的不足之处  61
  6.4 下一步值得研究的工作  61-62
参考文献  62-70
在读期间发表的论文题录  70-71
附录  71-74
  附录1 缩略词表  71-72
  附录2 扩增产物的序列  72-74
致谢  74

猪GFAT1与SLC2A基因家族中6个基因克隆、定位、SNP检测及与生产性状的关联分析

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