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利用SCOTS技术筛选鸭疫里氏杆菌体内外差异表达的基因

作　者: 郑娟
导　师: 李自力
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 鸭疫里氏杆菌毒力因子选择性捕获转录序列差异性表达
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌(Riemerella anantipestifer,RA)引起的一种接触性或慢性、败血性传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失,是目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。目前,对于RA的毒力因子以及致病的分子基础报道甚少,因此,本研究用选择性捕获转录序列(SCOTS)技术筛选鸭疫里氏杆菌在感染过程中特异性表达的基因,在分子水平上探讨RA的致病机理,为鸭疫里氏杆菌病的免疫预防和治疗提供理论基础。用常规方法提取了鸭疫里氏杆菌基因组,扩增出16S、23S rDNA,并对全基因组进行了生物素标记,采用超声波裂解方法将16S、23S rDNA和基因组生物素标记混合物进行裂解,获得了片段大小在100～2000bp之间的含16S、23S rDNA的RA基因组随机标记片段。以本实验室分离、鉴定的血清1型鸭疫里氏杆菌云梦分离株(RA-YM)感染7日龄樱桃谷肉鸭,提取感染鸭肝脏和TSB培养RA-YM的总RNA,合成cDNAs,分别记为体内感染库和体外培养库。应用SCOTS技术对体内感染库和体外培养库进行均一化处理以及基于PCR方法的体内感染特异性转录序列的选择性富集,选择性富集的体内感染特异性转录序列经过扩增与T载体连接,挑取阳性克隆进行测序。结果表明,本研究获得了16个RA在体内感染过程中特异性表达的基因,经对测序结果进行生物信息学分析,可将上述特异性表达基因分为六类:合成与代谢,适应性调节,应激,转运系统,蛋白酶和未知功能序列。细菌的蛋白酶是病原菌重要的毒力因子,本研究筛选到2个编码蛋白酶的基因,即二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)和锌依赖的肽酶(zdp)。格氏链球菌(Streptococcus gordonii)DPPⅣ可以酶解P物质,同时协同胞外精氨酸蛋白酶酶解缓激肽,导致血管通透性的变化以及感染的内皮组织平滑肌收缩。纤维素性渗出是鸭疫里氏杆菌感染的主要病理变化,因此,二肽肽酶Ⅳ可能是RA引起雏鸭腹腔浆膜面广泛性渗出的关键性毒力因子之一。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
缩略词表  10-11
第一章文献综述  11-25
  1 概述  11
  2 病原学  11-13
    2.1 分类地位  11-12
    2.2 RA的形态和染色特性  12
    2.3 培养基和理化特性  12
    2.4 血清型  12-13
  3 流行病学  13-14
    3.1 易感动物  13-14
    3.2 传染源和传播途径  14
    3.3 发病季节和诱病因素  14
    3.4 发病日龄  14
  4 临床症状与病理变化  14-15
    4.1 临床症状  14
    4.2 病理变化  14-15
  5 诊断方法  15-17
    5.1 细菌的分离鉴定  15
    5.2 凝集试验  15
    5.3 酶联接免疫吸附剂测定  15-16
    5.4 荧光抗体技术  16
    5.5 PCR  16-17
  6 免疫原性研究  17-18
  7 致病因子研究  18-19
  8 细菌体内基因差异表达技术  19-25
    8.1 体内表达技术(IVET)  19-20
    8.2 代表性差别分析技术(RDA)  20
    8.3 信号标签技术(STM)  20
    8.4 选择性捕获转录序列(SCOTS)  20-25
      8.4.1 SCOTS技术的原理  21-22
      8.4.2 SCOTS技术路线  22
      8.4.3 SCOTS技术的优缺点  22-25
第二章鸭疫里氏杆菌基因组的提取、生物素标记以及16S rDNA和23S rDNA的克隆  25-38
  1 研究的目的及意义  25
  2 材料与方法  25-32
    2.1 实验材料  25-27
      2.1.1 菌株和工具酶  25
      2.1.2 试剂  25
      2.1.3 主要试剂及溶液的配制  25-26
      2.1.4 本试验所采用的PCR引物  26-27
      2.1.5 主要仪器  27
    2.2 试验方法  27-32
      2.2.1 RA-YM基因组的提取及标记  27-28
      2.2.2 16S rDNA的PCR扩增  28-29
      2.2.3 23S rDNA的PCR扩增  29
      2.2.4 PCR产物回收与测序  29-30
      2.2.5 PCR产物的克隆  30
      2.2.6 感受态细胞制备(氯化钙法)  30-31
      2.2.7 质粒的转化  31
      2.2.8 质粒的小量制备(碱裂解法提取质粒)  31
      2.2.9 重组质粒的鉴定  31-32
      2.2.10 16S rDNA和23S rDNA的PCR扩增结果分析  32
      2.2.11 含16S、23S rDNA质粒的RA基因组随机标记片段的制备  32
  3 结果与分析  32-37
    3.1 RA-YM基因组  32
    3.2 16S rDNA的PCR扩增及酶切鉴定  32-34
      3.2.1 16S rDNA的PCR扩增  32-33
      3.2.2 16S rDNA的酶切鉴定  33-34
    3.3 23S rDNA的PCR扩增(分三段扩增)及酶切鉴定  34-36
      3.3.1 23S rDNA的PCR扩增  34-35
      3.3.2 23S rDNA的酶切鉴定  35-36
    3.4 RA基因组及rDNA质粒的破碎  36-37
  4 讨论  37
    4.1 RA基因组的提取及标记  37
    4.2 PCR扩增  37
    4.3 质粒的酶切鉴定  37
  5 小结  37-38
第三章选择性捕获转录序列  38-58
  1 研究的目的和意义  38
  2 材料与方法  38-46
    2.1 实验材料  38-39
      2.1.1 实验仪器  38
      2.1.2 主要试剂  38-39
      2.1.3 试验菌株和试验动物  39
      2.1.4 本实验所使用的引物  39
    2.2 实验方法  39-46
      2.2.1 RA-YM的复苏  39
      2.2.2 RA-YM的感染试验及样品采集  39-40
      2.2.3 组织总RNA的提取  40
      2.2.4 细菌总RNA的提取  40
      2.2.5 cDNA合成  40-42
      2.2.6 cDNAs的纯化回收  42
      2.2.7 预杂交  42
      2.2.8 转录序列捕获(SCOTS)  42-43
      2.2.9 RA感染过程中特异性转录cDNAs的富集  43-44
      2.2.10 RA感染过程中特异性转录cDNAs的克隆  44
      2.2.11 细菌转化  44-45
      2.2.12 cDNA克隆筛选  45
      2.2.13 斑点杂交  45-46
      2.2.14 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析  46
  3 结果与分析  46-53
    3.1 肝脏总RNA的提取及cDNA的合成  46-47
    3.2 RA总RNA的提取及cDNA合成  47-48
    3.3 选择性捕获转录序列(Selective capture of transcribed sequences)  48-50
    3.4 RA在感染过程中特异性转录序列的富集  50
    3.5 SCOTS所捕获的差异cDNA克隆  50
    3.6 斑点杂交结果  50
    3.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列预测分析  50-53
  4 讨论  53-56
    4.1 SCOTS  53-54
    4.2 RA体内感染差异表达的基因  54-56
      4.2.1 与代谢相关的基因  54-55
      4.2.2 适应性反应相关的基因  55-56
      4.2.3 蛋白酶类基因  56
    4.3 下一步工作计划  56
  5 小结  56-58
结论  58-59
参考文献  59-65
附录  65-68
致谢  68

利用SCOTS技术筛选鸭疫里氏杆菌体内外差异表达的基因

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