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普洱茶高温发酵过程中高温菌的初步研究

作　者: 张文明
导　师: 陈朝银
学　校: 昆明理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 普洱茶高温菌鉴定发酵代谢
分类号: TS272
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料通过微生物发酵而得,普洱茶的品质形成中,微生物起了重要作用。目前已报道分离得到的主要为真菌,有曲霉、青霉、根霉、和酵母等微生物,都为常温真菌,关于细菌的报道较少。现代普洱茶渥堆发酵过程,至少需要45天,而一般发酵温度在50℃以上,不翻堆的情况下可达到70℃以上,属典型的高温发酵,高温菌的存在及其作用不容忽视。本研究以发酵过程中高温菌的分离研究作为出发点,将得到的嗜热菌及耐热菌作为研究对象。样品采自云南勐海鹏程茶,通过四种分离培养基,将每次翻堆时所采集的样品进行稀释涂布培养,依据菌落特征对生长出来的菌落进行计数,初步了解茶叶发酵过程中高温菌数量的变化趋势。最后,分离纯化得到13株细菌,都能在50℃以上较好生长。对所有高温菌的生长特性都进行了研究,本实验对各菌株进行最适生长温度及其生长温度范围的测定,初步判断各菌株在茶叶不同的发酵阶段所起的作用。另外还测定了各菌株的最适生长pH值及生长pH值范围,初步判断各菌株在茶叶环境中的生长适应性。研究结果表明,10株为耐热细菌,3株为嗜热菌,且最适生长pH基本为中性,能很好地适应普洱茶高温发酵环境。关于13种菌株对普洱茶发酵影响进行了探索。在对照组的对比下,研究了各菌株的加入对普洱茶发酵过程中茶多酚、咖啡碱、游离氨基酸总量、茶黄素、茶红素、茶褐素的含量变化的影响。发现,菌株的加入对普洱茶的发酵有不同程度的影响。本论文还进行了微生物代谢特性研究,探索了13种菌株的酶学性质。结果表明各菌株发酵液都有不同程度的异淀粉酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、果胶酶、碱性蛋白酶活力,而部分菌株的产酶能力相对较强。这些微生物代谢性质赋予了各菌株在普洱茶发酵过程中的功能。最后,对部分菌株提取了基因组,扩增16S rDNA及测序,对序列进行了比对,构建出进化树。确定各菌株所在的属,并比对了各菌株与标准菌株的同源性,发现有三株属于放线菌。另外,对比较典型的两种菌株进行了生理生化试验,发现与已知相似菌株的生理生化特性有一定的差异。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
插图和附表清单  11-13
第一章前言  13-26
  1.1 普洱茶的品质特征及发酵过程  13-20
    1.1.1 普洱茶的加工工艺  13-15
    1.1.2 普洱茶的品质特征及形成  15-16
    1.1.3 普洱茶成分及在发酵过程中变化的研究  16-20
    1.1.4 固态发酵普洱茶与陈年普洱茶的理化成分差异  20
  1.2 普洱茶发酵过程中微生物的研究  20-23
    1.2.1 黑曲霉及对普洱茶品质的贡献  21
    1.2.2 酵母及对普洱茶品质的贡献  21-22
    1.2.3 青霉及对普洱茶品质的贡献  22-23
    1.2.4 根霉及对普洱茶品质的贡献  23
    1.2.5 灰绿曲霉及对普洱茶品质的贡献  23
  1.3 普洱茶发酵剂研究  23-24
  1.4 课题目的及立题依据  24-26
第二章普洱茶发酵过程中高温菌的分离  26-40
  2.1 引言  26
  2.2 材料与方法  26-27
    2.2.1 材料与主要试剂  26
    2.2.2 实验仪器  26-27
    2.2.3 培养基  27
  2.3 试验方法  27-28
    2.3.1 普洱茶样品的采集  27-28
    2.3.2 微生物的分离  28
    2.3.3 菌种的纯化  28
    2.3.4 菌体生物量的测定  28
    2.3.5 最适生长温度的测定及其嗜热性的确定  28
    2.3.6 最适生长pH值的测定  28
  2.4 结果  28-38
    2.4.1 微生物的分离  28-29
    2.4.2 茶叶发酵过程中部分菌株的数量变化  29-30
    2.4.3 细菌的纯化  30-35
    2.4.4 最适生长温度的测定及其嗜热性的确定  35-37
    2.4.5 最适生长pH值的测定  37-38
  2.5 小结  38
  2.6 讨论  38-40
第三章代谢特性的研究  40-55
  3.1 引言  40
  3.2 材料与方法  40-42
    3.2.1 材料与主要试剂  40-42
    3.2.2 实验仪器  42
  3.3 试验方法  42-45
    3.3.1 葡萄糖标准曲线的测定  42-43
    3.3.2 半乳糖醛酸标准曲线的绘制  43
    3.3.3 酪氨酸标准曲线绘制  43-44
    3.3.4 异淀粉酶活力测定  44
    3.3.5 纤维素酶活力测定  44
    3.3.6 果胶酶活性测定  44
    3.3.7 碱性蛋白酶活性的测定  44-45
  3.4 结果  45-52
    3.4.1 葡萄糖标准曲线  45-46
    3.4.2 D-半乳糖醛酸溶液标准曲线  46-47
    3.4.3 酪氨酸溶液标准曲线  47
    3.4.4 异淀粉酶活性  47-48
    3.4.5 纤维素酶活性  48-50
    3.4.6 果胶酶活性  50-51
    3.4.7 碱性蛋白酶活性  51-52
  3.5 小结  52-53
  3.6 讨论  53-55
第四章菌株对普洱茶发酵的影响  55-69
  4.1 引言  55
  4.2 材料与方法  55-56
    4.2.1 材料与主要试剂  55-56
    4.2.2 实验仪器  56
  4.3 试验方法  56-57
    4.3.1 水分的测定  56
    4.3.2 茶多酚含量的测定  56
    4.3.3 咖啡碱含量的测定  56
    4.3.4 游离氨基酸总量的测定  56-57
    4.3.5 茶色素含量的测定  57
    4.3.6 菌株对普洱茶发酵过程中成分变化的影响  57
  4.4 结果  57-63
    4.4.1 加入外源菌株对茶多酚含量变化的影响  57-59
    4.4.2 加入外源菌株对咖啡碱含量变化的影响  59-60
    4.4.3 加入外源菌株对游离氨基酸含量变化的影响  60-61
    4.4.4 加入外源菌株对茶黄素含量变化的影响  61-62
    4.4.5 加入外源菌株对茶红素含量变化的影响  62-63
    4.4.6 加入外源菌株对茶褐素含量变化的影响  63
  4.5 小结  63-64
  4.6 讨论  64-69
第五章生理生化实验及菌种鉴定  69-84
  5.1 引言  69
  5.2 材料与方法  69-70
    5.2.1 材料与主要试剂  69-70
    5.2.2 实验仪器  70
  5.3 试验方法  70-74
    5.3.1 生理生化试验  70-72
    5.3.2 16S rDNA序列的测定及分析  72-74
  5.4 结果  74-81
  5.5 小结  81-82
  5.6 讨论  82-84
总结与展望  84-86
致谢  86-87
参考文献  87-93
附录A 攻读学位期间发表论文  93-94
附录B 部分菌株的16S rDNA的序列  94-98

普洱茶高温发酵过程中高温菌的初步研究

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