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脂肪酸诱导鹅肝细胞差异表达基因的筛选和鉴定

作　者: 周泽惠
导　师: 王继文
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 抑制消减杂交 原代肝细胞 肝脂肪变性 差异表达基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


在动物肝细胞内,甘油三酯(TG)的异常沉积导致肝脂肪变性。将游离脂肪酸(FFAs)添加到肝细胞中可导致肝脂肪变性,但是关于FFAs与TG的异常沉积之间联系和脂肪沉积相关基因的差异表达的机制目前还不清楚。本研究以四川白鹅(Ansercygnoides)为研究对象,利用抑制消减杂交技术构建了FFAs诱导的肝脂肪变性细胞和正常肝细胞差异cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步揭示了FFAs诱导后肝细胞差异表达基因的种类和数量,这为从分子水平探讨肥肝的机理奠定了基础。本研究取得的主要结果如下:1.采用添加1mM游离脂肪酸混合物FFAs到鹅原代肝细胞中培养36h,成功建立肝细胞脂肪变性的细胞模型。2.应用抑制性消减杂交技术成功构建了正常肝细胞与脂肪变性肝细胞正反向SSH文库。正向文库(SSH-1)扩增后获得1344个克隆,反向文库(SSH-2)扩增后获得1152个克隆。应用斑点杂交筛选阳性克隆测序,SSH-1文库有30个测序成功,SSH-2文库有23个测序成功。3.对去除载体序列和接头序列后的EST通过BLASTn进行在线DNA序列同源性比较分析得到:SSH-1获得23个已知基因,占克隆测序的76.7%;已知EST有6个占20%;全新EST有1个占3.3%。其中SSH-2文库已知基因有18个占克隆测序的78.3%;已知EST有1个占4.3%,全新EST有4个占17.4%。4.SSH文库共获得已知基因41个,对EST功能分类发现,细胞结构和运动占已知基因的2%,细胞信号和传导占12%,翻译核糖体结构和功能占25%,细胞转录占5%,细胞凋亡占2%,物质转运占17%,物质代谢占22%,未知基因占15%。5.ALDOB、TGM3、RPL家族(RPL22、RPL23、RPL39、RPL5)、APoH等这些差异表达的EST序列与新基因片断在肝细胞的生长或脂肪代谢等过程中起了重要作用,为进一步研究肝脂肪变性提供了线索。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-8
主要英文缩略词语  8-11
1 文献综述  11-22
  1.1 脂肪的合成与分解  11-12
    1.1.1 脂肪合成代谢  11-12
    1.1.2 脂肪分解代谢  12
  1.2 肝脂肪变性研究  12-17
    1.2.1 肝脏脂肪酸生成  12-13
    1.2.2 肝脂肪变性发生的分子机制  13-15
    1.2.3 水禽肝脂质代谢相关基因研究进展  15-17
  1.3 表达序列标签(EST)技术及应用  17-21
    1.3.1 EST概念及原理  17
    1.3.2 EST的应用现状  17-19
    1.3.3 ESTs研究现状  19-21
  1.4 本研究的目的和意义  21-22
2 材料与方法  22-43
  2.1 试验材料  22
  2.2 仪器和试剂  22-26
    2.2.1 主要仪器设备  22-23
    2.2.2 菌种及载体  23
    2.2.3 引物和核苷酸序列  23
    2.2.4 主要试剂  23-24
    2.2.5 主要试剂配置  24-26
  2.3 试验方法  26-43
    2.3.1 鹅肝细胞分离及培养  26
    2.3.2 肝细胞总RNA提取  26-27
    2.3.3 mRNA分离纯化  27-28
    2.3.4 SSH文库的构建  28-35
    2.3.5 PCR产物纯化与消减文库的生成  35-38
    2.3.6 斑点杂交筛选阳性克隆  38-41
    2.3.7 表达序列标签(EST)测序  41
    2.3.8 EST生物信息学分析  41-43
3 结果与分析  43-55
  3.1 肝细胞的形态特征  43-44
  3.2 总RNA提取与mRNA分离纯化  44-45
    3.2.1 总RNA提取  44
    3.2.2 mRNA分离纯化  44-45
  3.3 SSH文库的构建  45-47
    3.3.1 ds cDNA的制备与Rsa I酶切  45
    3.3.2 接头连接效率分析  45
    3.3.3 消减产物第二次PCR扩增  45-46
    3.3.4 消减效率分析  46-47
  3.4 斑点杂交  47-48
  3.5 差异表达基因的生物信息学分析  48-55
    3.5.1 克隆测序  48
    3.5.2 EST基因的分类  48-49
    3.5.3 EST功能分类  49-55
4 讨论  55-62
  4.1 鹅肝细胞体外培养  55
  4.2 肝细胞脂肪变性模型的建立  55-56
  4.3 SSH文库构建的质量评价  56-58
  4.4 脂肪酸诱导肝细胞差异表达基因  58-62
    4.4.1 PRL家族(RPL22、RPL23、RPL39、RPL5)  58-59
    4.4.2 谷氨酰胺转氨酶3(TGM3)  59
    4.4.3 凝血栓蛋白(THBS1)  59-60
    4.4.4 载脂蛋白H(APoH)  60
    4.4.5 脂肪酸结合蛋白(FABP)  60-62
结论  62-63
参考文献  63-69
致谢  69-70
附录  70-71
硕士研究生学习期间参与科研项目及发表文章  71

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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