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微生物催化环氧黄体酮羟化脱氢过程新工艺研究

作　者: 李久红
导　师: 关怡新
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 黑根霉水溶液悬浮投料短刺小克银汉霉菌简单节杆菌吐温-80乳化投料水/有机溶剂两相体系 NaCS/PDMDAAC微胶囊固定化混合发酵
分类号: TQ467
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

肾上腺皮质激素类药物,作为甾类激素药物中重要的组成部分,是临床上不可缺少的一类药物。一般采用以天然的甾体化合物为原料,利用化学法和微生物转化法相结合的合成工艺,其中利用微生物法进行转化的C₁₁-羟化反应和C_1,2-脱氢反应是合成过程中的关键步骤。C₁₁位上羟基的引入对肾上腺皮质激素药物的抗炎活性是必不可少的,而C_1,2位置导入双键后,能成倍地增加其抗炎作用。本文以环氧黄体酮为原料,对黑根霉11α-羟化反应、短刺小克银汉霉菌11β-羟化反应、简单节杆菌C_1,2-脱氢过程进行了优化,研究了甾类药物生物催化的新工艺。首先在黑根霉11α-羟化反应过程中,确定了最佳pH,优化了培养基碳源,并建立了添加十二烷基苯磺酸钠的水溶液悬浮投料方式,在3.7L发酵罐的放大实验中,投料浓度高达15g/L时,转化率可达49.2%,且催化过程稳定。其次证实了短刺小克银汉霉菌具有11β-羟化能力,但该反应副产物较多,催化过程不稳定。对其转化工艺中的操作参数,如pH、转速、接种量、培养基等进行了优化,在10L发酵罐的放大实验中,投料浓度为2g/L时,11β-羟化产物得率可稳定在35%。对简单节杆菌的脱氢过程进行了新工艺研究。建立了吐温-80乳化投料方式,并用响应面法进行了优化;构建了水/正己烷两相反应体系;研究了NaCS/PDMDAAC微胶囊固定化简单节杆菌细胞培养;利用固定化简单节杆菌,在气升式反应器中采用水/正已烷两相反应体系进行了脱氢过程,结合吐温-80乳化投料的最优添加物,反应2h即能达到97.54%的高转化率,5批次重复投料实现了半连续化生产,每批次的转化率都在95%以上。最后尝试将催化性能稳定的黑根霉和简单节杆菌进行混合发酵培养,采用静息细胞转化工艺,实现了环氧黄体酮一步羟化和脱氢反应,确立了工艺条件磷酸缓冲溶液的最佳pH值为6.0,最适宜的投料浓度为2g/L,多批次的重复实验结果表明该混合发酵体系具有一定的稳定性。

全文目录

致谢  6-7
摘要  7-8
Abstract  8-13
第一章文献综述  13-30
  1.1 肾上腺皮质激素类药物概述  13-16
    1.1.1 肾上腺皮质激素类药物的应用  13-14
    1.1.2 肾上腺皮质激素类药物的结构  14-15
    1.1.3 肾上腺皮质激素类药物的生产工艺  15-16
  1.2 甾类化合物的微生物转化  16-18
    1.2.1 甾类化合物微生物转化概述  16-17
    1.2.2 甾类化合物微生物转化的反应类型  17-18
  1.3 甾类化合物微生物11-羟化反应  18-20
    1.3.1 甾体11-羟化反应研究进展  18-19
    1.3.2 羟化反应机理  19-20
    1.3.3 具有甾体11-羟化能力的菌种  20
  1.4 甾类化合物微生物C_(1,2)-脱氢反应  20-22
    1.4.1 甾体C_(1,2)-脱氢反应研究进展  20-21
    1.4.2 脱氢反应机理  21
    1.4.3 具有甾体C_(1,2)-脱氢能力的菌种  21-22
  1.5 甾体药物微生物转化中新技术的应用  22-28
    1.5.1 原生质体转化技术  22-23
    1.5.2 细胞固定化技术  23-25
    1.5.3 双水相体系中的转化  25-26
    1.5.4 水/有机溶剂两相反应体系中的转化  26
    1.5.5 混合发酵技术  26-27
    1.5.6 外加作用因子对甾体转化的影响  27-28
  1.6 本文的研究思路及目标  28-30
第二章环氧黄体酮11-羟化工艺的研究  30-51
  2.1 引言  30-31
  2.2 实验材料与仪器  31-32
    2.2.1 菌种  31
    2.2.2 试剂  31
    2.2.3 培养基  31
    2.2.4 仪器及设备  31-32
  2.3 分析方法  32-34
    2.3.1 生物量的测定  32-33
    2.3.2 高效液相色谱法测定转化率和得率  33-34
    2.3.3 薄层层析法测定转化率  34
  2.4 实验方法  34-36
    2.4.1 短刺小克银汉霉菌催化产物的分离和鉴定  34-35
    2.4.2 培养条件优化  35
    2.4.3 投料方式研究  35-36
  2.5 结果与讨论  36-49
    2.5.1 黑根霉11α-羟化反应工艺研究  36-42
    2.5.2 短刺小克银汉霉菌11β-羟化反应工艺研究  42-49
    2.5.3 黑根霉羟化过程和短刺小克银汉霉菌羟化过程的比较  49
  2.6 本章小结  49-51
第三章 11α-羟基环氧黄体酮C_(1,2)-脱氢反应  51-72
  3.1 引言  51-52
  3.2 实验材料与仪器  52-53
    3.2.1 菌种  52
    3.2.2 试剂  52
    3.2.3 培养基  52-53
    3.2.4 仪器及设备  53
  3.3 分析方法  53-55
    3.3.1 生物量的测定  53
    3.3.2 高效液相色谱法测定转化率  53-54
    3.3.3 薄层层析法测定转化率  54
    3.3.4 简单节杆菌脱氢酶酶活的测定  54
    3.3.5 11α-羟基环氧黄体酮在不同有机溶剂中溶解度的测定  54-55
    3.3.6 微胶囊机械强度的测定  55
  3.4 实验方法  55-58
    3.4.1 简单节杆菌微胶囊制备  55-56
    3.4.2 培养转化条件优化  56-57
    3.4.3 投料方式研究  57-58
  3.5 结果与讨论  58-70
    3.5.1 吐温-80乳化投料  58-62
    3.5.2 水/有机溶剂两相反应体系的构建  62-65
    3.5.3 NaCS的不同灭菌方式对微胶囊性能的影响  65-67
    3.5.4 微胶囊固定化细胞脱氢反应过程的研究  67-70
  3.6 本章小结  70-72
第四章黑根霉和简单节杆菌混合发酵催化过程  72-80
  4.1 引言  72-73
  4.2 实验材料与仪器  73
    4.2.1 菌种  73
    4.2.2 试剂  73
    4.2.3 培养基  73
    4.2.4 仪器及设备  73
  4.3 分析方法  73
  4.4 实验方法  73-74
    4.4.1 菌丝体的培养  73
    4.4.2 静息细胞转化工艺  73-74
    4.4.3 混合发酵工艺  74
  4.5 结果与讨论  74-79
    4.5.1 缓冲溶液pH对黑根霉菌静息细胞转化过程的影响  74-75
    4.5.2 缓冲溶液pH对简单节杆菌静息细胞转化过程的影响  75
    4.5.3 缓冲溶液pH对混合发酵过程影响  75-77
    4.5.4 不同投料浓度对混合发酵过程的影响  77
    4.5.5 混合发酵过程的稳定性研究  77-78
    4.5.6 讨论  78-79
  4.6 本章小结  79-80
第五章结论与建议  80-83
  5.1 结论  80-81
  5.2 建议  81-83
参考文献  83-87
攻读硕士学位期间研究成果  87-88
附图  88-92

微生物催化环氧黄体酮羟化脱氢过程新工艺研究

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