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治疗型VP22△-mE6△/mE7重组蛋白疫苗的表达与免疫学初步分析

作　者: 高丹丹
导　师: 徐维明；李健峰；李智华；戴宗祥
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: HPV—16 重组蛋白疫苗 分子内佐剂 VP22△ mE6△/mE7
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一,据统计,世界上每年的新发病例约46万,每年约有25万人死于宫颈癌。在我国,每年宫颈癌的新发病例数超过13万,每年死于宫颈癌的妇女约有5万人。随着研究的深入,宫颈癌与人乳头瘤病毒的关系越来越被基础研究者和临床医生所重视。近年来越来越多的科学家致力寻找宫颈癌的致病病因,并希望借此提高宫颈癌的治疗和预防水平。HPV是一种环状双链结构的DNA病毒,由7800-7900碱基对组成,由3个基因区组成。其ORFs包含6个早期转录单位和2个晚期转录区。E6和E7被认为是HPV的癌基因,可分别与P53和视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,PRB)结合,使这两种抑癌基因失活。HPV的分类到目前为止,已发现和鉴定出超过100种不同类型,有54种可以感染生殖道黏膜。其中,高危型HPV-16、18型可在多数宫颈癌、一些肛管癌和阴道癌中检测到。有关HPV-16的治疗型蛋白疫苗国内外已有相关研究,治疗型分子内佐剂疫苗的研究已成为当今疫苗的研究热点。VP22是Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)间层的主要蛋白,位于病毒衣壳与内膜之间。VP22蛋白表现出在细胞间转运的特性,可将与其融合的蛋白分子高效地带入其转移的细胞。有研究者将VP22与肿瘤抗原人乳头瘤病毒E7蛋白构建到辛德比斯病毒RNA复制载体上,免疫小鼠后VP22-E7能够诱导较强的E7特异性CDS+T细胞活性,同时有较明显的抗E7的肿瘤活性。后续研究发现,VP22的细胞转导效应是由于该蛋白C末端的34个氨基酸参与了细胞粘附,并且由于这段多肽富含带有正电荷的碱性氨基酸残基,它们可与带负电荷的细胞膜相互作用,然后将与之相融合的蛋白以非折叠方式跨膜进入细胞,增强了与之融合蛋白与细胞的相互作用。本研究将HSV-1 VP22蛋白转导活性结构域(protein transduction domain,PTD)与HPV-16的mE6△/mE7基因融合,使VP22△-mE6△/mE7融合蛋白在原核表达系统中得到较高效表达。在此基础上摸索重组蛋白纯化工艺,并进一步研究其在体外所诱发的细胞特异性免疫反应及在小鼠体内的抗TC-1移植瘤生长的生物学活性。实验结果表明,VP22△-mE6△/mE7蛋白除在小鼠体内能够激发产生高滴度特异性抗体外,也能在小鼠体内诱导特异的细胞免疫反应,该活性对HPV-16引发的肿瘤治疗具有重要作用。经VP22△-mE6△/mE7免疫后小鼠的脾淋巴细胞在体外被抗原再次刺激时,细胞增殖反应显著高于免疫了mE6△/mE7蛋白和PBS的小鼠,表明可在小鼠体内诱导出针对该抗原的淋巴细胞特异性应答。此外,TC-1细胞致瘤小鼠经VP22△-mE6△/mE7免疫治疗后表现出了较mE6△/mE7治疗组更高的对TC-1特异性杀伤作用,使该蛋白具备了可能作为HPV-16型感染所致相关疾病的治疗性疫苗的价值。本研究表明,VP22△-mE6△/mE7重组蛋白疫苗能诱导一定水平的特异性体液免疫和细胞免疫应答,致瘤小鼠体内实验证实该蛋白疫苗在肿瘤治疗中能起到一定的作用,这也为其它新型无佐剂治疗性疫苗的研制提供了新的思路。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
材料与方法  14-29
  (一) 实验材料  14-16
    1. 质粒、菌株和细胞  14
    2. 工具酶  14
    3. 分子量标准  14
    4. 试剂盒  14
    5. DNA合成、测序  14
    6. 抗体  14-15
    7. 层析介质  15
    8. 主要化学试剂  15
    9. 主要仪器  15
    10. 实验动物  15
    11. 佐剂  15-16
    12. 其他材料  16
  (二) 基本实验操作  16-20
    1. 质粒 DNA的小量提取  16
    2. 大肠杆菌感受态细胞的制备  16-17
    3. 质粒或连接产物转化大肠杆菌感受态细胞  17
    4. DNA片段胶回收及无水乙醇沉淀  17-18
    5. 测定蛋白浓度  18
    6. Western blot免疫印迹  18-19
    7. ELISE酶联免疫吸附试验  19-20
  (三) 引物设计、目的基因扩增及重组克隆载体的构建  20-24
    1. 引物设计与合成  20
    2. VP22△、mE6△/mE7基因的扩增、Linker片段的制备  20-22
    3. PCR结果鉴定及产物回收  22
    4. PMD18-T-VP22△-mE6△/mE7重组克隆载体的构建  22
    5. 重组原核表达质粒pET28a-VP22△-mE6△/mE7的构建及鉴定  22-24
  (四) 重组质粒pET28a-VP22△-mE6△/mE7的诱导表达及表达条件优化  24-25
    1. 诱导表达  24
    2. 优势表达菌株的筛选和保存  24-25
    3. pET28a-VP22△-mE6△/mE7重组质粒诱导条件的优化  25
    4. 凝胶扫描测定所得到的蛋白表达量  25
  (五) 目的蛋白的大量表达及纯化  25-26
    1. 蛋白的表达和收集  25-26
    2. 蛋白的复性及纯化  26
  (六) VP22△-mE6△/m E7重组蛋白的WesternBlot检测  26
  (七) VP22-E6E7重组蛋白免疫学分析  26-29
    1. 小鼠的免疫和血清特异IgG效价测定  26-27
    2. 小鼠脾淋巴细胞增殖试验  27-28
    3. TC-1小鼠肿瘤移植模型的建立和肿瘤治疗试验  28-29
结果与分析  29-36
  (一) VP22△、ml6△/mE7基因片段的亚克隆及表达载体的构建  29-31
    1. VP22△、mE6△/mE7基因片段的扩增  29
    2.P ET28a-VP22-E6E7表达载体的构建及鉴定  29-31
  (二) pET28a-Vp22-E6E7的诱导表达  31-33
  (三) 重组融合蛋白的大量表达、纯化及鉴定  33-34
  (四) 小鼠的免疫和血清特异 IgG效价测定  34-35
  (五) 小鼠脾淋巴细胞增殖试验  35
  (六) TC-1小鼠肿瘤移植模型的建立和肿瘤治疗试验  35-36
讨论  36-41
小结  41-42
参考文献  42-47
论文综述  47-63
附录  63-70
致谢  70-71
作者简历  71
发表的文章  71-72

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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