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毛白杨杂种外源基因稳定性及对土壤微生物的影响

作　者: 魏冰
导　师: 李云
学　校: 北京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 毛新杨×毛白杨转基因植物基因稳定性土壤微生物基因水平转移
分类号: S792.117
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

毛白杨是我国特有的乡土树种,广泛应用于城市园林绿化,工业人工林和农田防护林建设。但当土壤的NaCl含量超过0.3%时便不能生长,这就严重限制了毛白杨的推广范围。为提高毛白杨的耐盐性,本实验室成功地将AhDREB1基因转化到三倍体毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)中,并进入限制性田间试验。由于转基因植物的环境释放存在很多潜在的生物安全风险,在其环境释放之前对转基因植物的生物安全性进行科学、全面的评估是十分必要的。转基因植物中外源基因的稳定性、对土壤微生物种群数量的影响以及外源基因的水平转移,是评估转基因植物生态安全性的重要组成部分。本研究以种植于山东省东营市试验林达3年的转35S:AhDREB1基因三倍体毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)为材料,利用荧光定量PCR技术,定量分析了该转基因植株中外源基因的拷贝数和在不同组织器官中转录水平上的表达量,结果证明AhDREB1基因仍稳定整合在转基因植株基因组中,拷贝数在植株个体间也没有明显差异;AhDREB1基因在转基因植株的各组织器官中都有转录,并且在植株个体间和各组织器官间的转录量都没有明显差异。进一步进行表型分析,以转基因植株的茎段为外植体在不同NaCl浓度的培养基中培养,结果发现转基因植株的耐盐度明显高于非转基因植株,在NaCl浓度0.5%时仍能正常生长,在NaCl浓度0.5%-0.7%时也能生存,但生长迟缓。分子检测和表型分析的结果都证明田间试验3年后,外源基因AhDREB1仍稳定整合并能正常的功能表达,没有发生基因沉默。采用平板稀释法对转基因与非转基因植株的根系土壤微生物进行种类和数量分析,结果表明转基因植株与非转基因植株间根系土壤中3大类微生物(细菌、放线菌和真菌)的数量存在细微差异,方差分析表明差异不显著,说明转基因植株尚未对土壤微生物的种类和数量造成显著影响。利用AhDREB1基因特异引物对土壤总DNA和筛选的卡那霉素抗性菌株DNA进行PCR扩增,均未检测到外源基因的扩增产物,表明该转基因植株中的外源基因尚未水平转移到土壤微生物中。上述研究初步检测了转AhDREB1基因三倍体毛白杨杂种(毛新杨×毛白杨)田间试验后外源基因的稳定性和对土壤微生物种类和数量的影响以及外源基因的水平转移。在该转基因植株进入生殖生长产生花粉之前,评估其可能存在的其他生态安全风险,为今后该转基因植株大规模的环境释放和制定科学、安全的转基因林管理方案提供参考。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略词表  7-10
引言  10-12
1 文献综述  12-24
  1.1 转基因林木概况  12
  1.2 外源基因表达的稳定性和表达量的研究  12-14
  1.3 转基因植物安全性检测的研究进展  14-24
    1.3.1 基因垂直转移  15-16
    1.3.2 基因水平转移  16-18
    1.3.3 杂草化  18-19
    1.3.4 对非目标生物的影响  19-20
    1.3.5 对土壤生态的影响  20-21
    1.3.6 其他影响  21-24
      1.3.6.1 外源基因对受体植物其他性状的影响  21-22
      1.3.6.2 转基因植物中35S启动子的生物安全性  22
      1.3.6.3 病毒的异源包装  22-24
2 研究思路与技术路线  24-26
3 外源基因稳定性的分子检测  26-33
  3.1 材料与方法  26-29
    3.1.1 材料  26
    3.1.2 基因组DNA的提取与PCR检测  26-27
    3.1.3 植物总RNA的提取和cDNA的制备  27-28
    3.1.4 实时荧光定量PCR  28-29
  3.2 结果与分析  29-31
    3.2.1 外源AhDREB1基因的PCR检测  29
    3.2.2 转基因植株中AhDREB1基因拷贝数的定量分析  29-30
    3.2.3 转基因植株中AhDREB1基因表达量的定量分析  30-31
  3.3 讨论  31-33
4 转基因植株耐盐表型分析  33-40
  4.1 材料与方法  33
    4.1.1 材料  33
    4.1.2 植物组织培养基  33
    4.1.3 NaCl浓度梯度培养  33
  4.2 结果与分析  33-38
    4.2.1 转基因组培苗的耐盐分化  33-36
    4.2.2 转基因组培苗的耐盐生根  36-38
  4.3 讨论  38-40
5 转基因植株对土壤微生物的影响  40-46
  5.1 材料与方法  40-41
    5.1.1 材料  40
    5.1.2 土样中微生物的分离培养及菌落计数  40
    5.1.3 土壤总DNA和菌株DNA的提取  40-41
    5.1.4 土壤总DNA和菌株DNA的PCR检测  41
  5.2 结果与分析  41-44
    5.2.1 根系周围土壤微生物种群数量的比较  41-43
    5.2.2 土壤总DNA的PCR检测  43
    5.2.3 AhDREB1水平转移的检测  43-44
  5.3 讨论  44-46
6 结论与研究展望  46-48
  6.1 结论  46-47
  6.2 研究展望  47-48
参考文献  48-57
图版  57-58
作者简介  58-59
导师简介  59-60
致谢  60

毛白杨杂种外源基因稳定性及对土壤微生物的影响

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