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酶催化机理及蛋白质折叠的研究

作　者: 邢达杰
导　师: 黄积涛
学　校: 天津理工大学
专　业: 应用化学
关键词: 生物印迹人工酶蛋白质折叠二态和三态折叠动力学
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

本文属酶蛋白结构与功能的研究,主要分为两个部分:其一、以生物印迹方法制备人工酶;其二、二态和三态折叠动力学的识别。前者是以实验为手段,后者则是理论研究。在制备生物印迹酶方面,利用蛋白质在水溶液中的柔性,分别采用两种方法对蛋白质进行生物印迹:以热变性法对蛋清蛋白进行生物印迹,以及用溶解沉淀法对牛血清蛋白进行生物印迹。进而,采用溶解沉淀法对鲱鱼精脱氧核糖核酸进行生物印迹。底物模板采用苯甲酰-L-精氨酸乙酯、苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺、苯甲酰-L-精氨酸。以紫外-可见光分光光度计分别检验生物印迹产物的催化活性。结果表明,两种印迹方法印迹的三种生物印迹酶均具有催化能力,这意味着生物印迹方法在生物大分子结构中形成了有效的活性凹洞。鲱鱼精脱氧核糖核酸的生物印迹也可提高其对水解反应的催化能力,说明并不是只有蛋白质和天然核酶才拥有酶的活性。核酸在人工构建活性凹洞后亦能显示出一定的催化活性。在蛋白质折叠理论研究方面,蛋白质以两种动力学途径进行针对具有完全不同的折叠速率、折叠中间态和折叠机理。如何识别折叠动力学途径是蛋白质折叠动力学研究的基础。本文利用逻辑斯蒂回归和支持向量机来判别二态和三态蛋白质的折叠途径。我们观察到,链长可以准确地识别三态蛋白质。112个残基的长度是两种折叠模型的过渡分界线。来自氨基酸组成的逻辑预测显示,半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、赖氨酸在折叠动力学途径上起重要的作用,二硫桥和疏水核由于稳定了中间态,从而导致了三态折叠行为。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
前言  10-12
第一章文献综述  12-44
  1.1 酶的概述  13-16
    1.1.1 酶的简史  13-15
    1.1.2 酶促反应的特点  15-16
  1.2 酶的重要意义  16-17
  1.3 酶催化的学说  17-19
    1.3.1 锁钥配合说  17
    1.3.2 诱导契合说  17-18
    1.3.3 两种学说中酶的作用机制  18-19
  1.4 人工模拟酶  19-23
    1.4.1 模拟酶的理论基础  20-21
    1.4.2 模拟酶的研究进展  21-23
  1.5 生物印迹酶  23-26
    1.5.1 生物印迹技术概述  23-25
    1.5.2 生物印迹酶  25-26
  1.6 蛋白质结构介绍  26-42
    1.6.1 蛋白质简介  26-28
    1.6.2 组成蛋白质的氨基酸  28-32
    1.6.3 蛋白质的一级结构  32-33
    1.6.4 蛋白质的二级结构  33-37
    1.6.5 蛋白质的三级结构  37-41
    1.6.6 蛋白质的四级结构  41-42
  1.7 研究意义与设想  42-44
第二章以生物印迹方法制备人工酶  44-59
  2.1 实验部分  44-48
    2.1.1 实验原料  44-45
    2.1.2 实验仪器  45
    2.1.3 实验步骤  45-48
      (1) 磷酸盐缓冲溶液的配制  45
      (2) 热变性法对蛋清蛋白质进行生物印迹  45-46
      (3) 溶解沉淀法印迹  46-47
        (I) 胰蛋白酶的空溶解沉淀法分散  46
        (II) 牛血清白蛋白(BSA) 的生物印迹  46
          (A) 以苯甲酰-L-精氨酸(BA) 为印迹模板  46
          (B) 以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE) 为印迹模板  46
        (III) 鲱鱼精脱氧核糖核酸的生物印迹  46-47
      (4) 催化活性检测  47-48
        (I) BAEE 印迹的蛋清蛋白质催化活性实验  47
        (II) 胰蛋白酶的非均相催化活性实验  47
        (III) BA 印迹的BSA 催化活性实验  47
        (IV) BAEE 印迹的BSA 催化活性实验  47-48
        (V) BAEE 印迹的鲱鱼精脱氧核糖核酸的催化实验  48
  2.2 结果与讨论  48-59
    2.2.1 技术原理  48-52
      (1) 生物印迹  48-49
        (I) 热变性法生物印迹  48
        (II) 溶解沉淀法生物印迹  48
        (III) 冻干法生物印迹  48-49
      (2) 人工酶催化  49-50
      (3) 光谱性质  50-51
      (4) 活性测定  51-52
    2.2.2 热变性生物印迹酶的活性测定  52-54
    2.2.3 胰蛋白酶的非均相催化活性测定  54
    2.2.4 BA 印迹的BSA 生物印迹酶的活性测定  54-56
    2.2.5 BAEE 印迹的BSA 生物印迹酶的活性测定  56-57
    2.2.6 BAEE 印迹的鲱鱼精脱氧核糖核酸生物印迹酶的活性测定  57-59
第三章二态和三态折叠动力学的识别  59-67
  3.1 理论模型  59-61
    3.1.1 二元逻辑斯蒂回归  59-60
    3.1.2 支持向量机  60
    3.1.3 预测精度的测量  60
    3.1.4 定义敏感性、特异性、准确性和 Matthews 相关系数  60-61
    3.1.5 蛋白质数据  61
  3.2 结果与讨论  61-67
    3.2.1 二态折叠与链长的关系  61-63
    3.2.2 从氨基酸组成识别二态蛋白质  63-67
总结论  67-68
参考文献  68-74
发表论文和科研情况  74-75
致谢  75-76

酶催化机理及蛋白质折叠的研究

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