学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

hPPARα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

作　者: 刘华
导　师: 周岐新；凌保东
学　校: 重庆医科大学
专　业: 药理学
关键词: MBP hPPARα HPLC-UV 配体筛选
分类号: R965.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 4次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的建立人过氧化物酶体增殖物活化受体alpha(human peroxisome prolifterator-activated receptors alpha,hPPARα)配体的HPLC-UV法筛选平台。方法含重组质粒的宿主菌(pMAL-p2X-hPPARs/TB1)经最佳优化条件诱导后,超声破碎取上清,产物用多糖亲和树脂进行纯化获MBP-hPPARsLBD,再用Xa因子酶切、多糖亲和树脂层析和DEAE-52阴离子交换层析纯化回收hPPARsLBD。采用HiTrap desalting (SephadexG-25,1.6×2.5cm)色谱柱,柱温8℃,以PBS为流动相,进样量为20μL,洗脱速度为1.0 mL/min。以检测苯扎贝特(Bez)进行方法学考察。然后取40μg hPPARαLBD或80μg MBP-hPPARαLBD,以Bez为阳性配体, AA为竞争性冷药,反应达平衡后取100μL进样,进行结合反应条件的优化。在优化的反应条件下,取不同浓度的Bez(阳性药)和罗格列酮(Ros)(阴性药)进行结合实验,计算特异性结合(SB)。根据实验结果确立HPLC-UV法筛选hPPARs配体的判断标准。最后以hPPARα的选择性激动剂非诺贝特(Fen)和Bez、hPPARγ的选择性激动剂Ros和吡格列酮(Pio)为待试药,检验所建立的HPLC-UV法hPPARs配体筛选平台的有效性。结果含重组质粒的宿主菌经最佳优化条件诱导,从1L培养物中可获得约20 mg MBP-hPPARsLBD。经纯化以及酶切回收,获得了电泳纯的MBP-hPPARsLBD和hPPARsLBD,其产量分别为14 mg/L和5 mg/L。色谱图中PPARs的保留时间为1.6 min,而Bez的保留时间为6.3min。分离效果较好,柱效高,峰形对称。Bez在0.5-200μmol/L(3.6-1447 ng)范围内线性良好, LOD为0.2μmol/L,,日内、日间RSD均小于5%。MBP-hPPARαLBD和hPPARαLBD同Bez的结合按照最佳优化条件(25℃孵育40 min pH值分别以8.4和8.00,)反应,SB/TB值均超过了65%。根据分子排阻色谱分离(Molecular Exclusion Chromatography,MEC)理论,取不同浓度的Bez(阳性药)和Ros(阴性药)进行结合实验,确定SB同药物浓度存在量-效关系作为hPPARs配体的判断标准,建立了HPLC-UV法hPPARα配体筛选平台。经检验,该平台能从待试药中有效地筛查出hPPARα的阳性配体。获得Bez和Fen的KD值分别为0.91和2.41μmol/L。结论HPLC-UV法筛选hPPARα配体是一种简便、有效的受体配体筛选方法。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
论文正文：hPPARα配体HPLC-UV 法筛选平台的建立  11-30
  前言  11-13
  第一部分 hPPARαLBD 和hPPARγLBD 的制备  13-16
    1 实验材料和方法  13-15
    2 实验结果  15-16
  第二部分采用HPLC-UV 法建立hPPARa 配体筛选平台  16-30
    1 实验材料和方法  16-19
    2 实验结果  19-26
    3 讨论  26-30
全文小结  30-31
参考文献  31-34
文献综述：PPARδ功能及其配体的研究进展  34-46
致谢  46

hPPARα配体的HPLC-UV法筛选平台的建立

内容摘要

全文目录

相似论文