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大蒜素对同型半胱氨酸诱导的兔血管平滑肌细胞增殖作用的实验研究

作　者: 杨静
导　师: 刘德山
学　校: 山东中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 大蒜素 同型半胱氨酸 血管平滑肌细胞 增殖
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:1.观察大蒜素(Allicin)对同型半胱氨酸(Hcy)诱导的兔血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响;2.观察Allicin对体外培养的兔VSMCs增殖细胞核抗原(PCNA)、c-myc及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响;3.为Allicin防治高同型半胱氨酸血症(HHcy)及其所致的动脉粥样硬化(AS)提供理论依据。方法:组织贴块法培养原代兔VSMCs,采用差速贴壁法进行纯化,取对数生长期的第4-6代细胞用于实验。由Hcy诱导建立细胞增殖模型,将细胞随机分为6组,对照组、Hcy组(只加Hcy,终浓度为1mmol/L)、Allicin组中加入Hcy(终浓度为1mmol/L)和不同浓度的Allicin(终浓度分别为10、5、2.5 ug/ml)、叶酸组加入Hcy(终浓度为1mmol/L)和叶酸(终浓度为5mmol/L)。通过MTT比色法检测细胞的增殖活度,免疫细胞化学技术检测PCNA的表达及Real-time PCR技术检测c-myc、bFGF mRNA的表达。结果:1、MTT检测结果显示,Hcy作用于VSMCs后,能诱导其增殖, Hcy组与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。与Hcy组比较,不同浓度的Allicin均能明显抑制VSMCs增殖(P<0.01),并且呈剂量依赖关系,Allicin大中剂量组作用强于叶酸组(P<0.01)。2、免疫细胞化学检测结果显示,镜下观察对照组PCNA阳性表达定位于胞核,呈现棕黄色。分析结果显示:与对照组比较,Hcy组VSMCs的PCNA的表达明显增强(P<0.01)。与Hcy组比较, Allicin大、中、小剂量组均能抑制PCNA蛋白的表达,随着Allicin浓度的增大,PCNA的表达逐渐减弱(P<0.01),且Allicin大、中剂量组的抑制作用强于叶酸组(P<0.01或P<0.05)。3、Real-time PCR待测mRNA的表达结果显示,与对照组相比,Hcy组可明显使c-myc、bFGF表达上调,差异具有统计学意义(P<0.01),与Hcy组比较,Allicin大、中、小剂量组均能明显抑制Hcy诱导的VSMCs中的c-myc、bFGF mRNA表达,并且随Allicin浓度的增加,抑制作用增强(P<0.01), Allicin大、中剂量组的作用均强于叶酸组(P<0.05),Allicin小剂量组与叶酸组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Allicin能显著抑制Hcy诱导的VSMCs的增殖,表现出剂量依赖效应;其作用机制可能与其下调PCNA蛋白、下调c-myc mRNA及bFGF mRNA表达密切相关。

全文目录


提要  3-5
ABSTRACT  5-9
引言  9-11
实验材料与试剂  11-15
  一、实验动物  11
  二、主要仪器设备  11-12
  三、实验试剂  12-13
  四、主要溶液及试剂的配制  13-15
实验方法  15-21
  一、细胞原代培养、鉴定及实验分组  15-17
    （一） 兔VSMCs 的原代培养和纯化  15
    （二） VSMCs 的免疫细胞化学鉴定  15-16
    （三） 建立Hcy 诱导的兔VSMCs 增殖模型及实验分组  16-17
  二、MTT 分析  17
  三、免疫细胞化学染色检测PCNA 的蛋白表达  17-18
  四、实时荧光定量PCR 检测平滑肌细胞中c-myc、bFGF mRNA 的表达  18-20
    （一） 细胞总RNA 的提取  18-19
    （二） 逆转录(RT)反应  19
    （三） Real-time PCR  19-20
  五、数据处理  20-21
结果  21-22
  一、兔VSMCs 的倒置相差显微镜结果和鉴定  21
  二、实验各组药物对VSMCs 增殖活度的影晌  21
  三、PCNA 在VSMCs 内的表达及其相互关系  21
  四、Real-time PCR 检测c-myc、bFGF mRNA 表达水平的变化  21-22
讨论  22-35
  一、VSMCs 的原代培养  22-23
  二、VSMCs 增殖在AS 中的作用  23
  三、HHcy 是AS 的重要危险因素  23-26
    （一） Hcy 的代谢  24
    （二） 影响Hcy 代谢的因素  24-25
    （三） HHcy 致AS 的机制  25-26
  四、PCNA、c-myc、bFGF 对AS 进程中VSMCs 增殖的作用  26-28
  五、AS 的中医学病因病机分析  28-33
    （一） AS 的病因病机  29-32
    （二） HHcy 的病因病机  32-33
  六、Allicin 的药理学研究  33-35
结语  35-36
参考文献  36-43
附录  43-46
  附图  43-45
  附表  45-46
符号说明  46-47
致谢  47-48
论文著作  48-53
详细摘要  53-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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