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白花丹醌增强TRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡及其机制研究

作　者: 徐同鹏
导　师: 刘立根
学　校: 复旦大学
专　业: 内科学
关键词: Kasumi-1细胞 凋亡 白花丹醌 TRAIL DR5 Bax cFLIP reaetive oxygen species(ROS)
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究背景：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF Related Apoptosis Inducing Ligand, TRAIL)是TNF超家族成员之一,是一种Ⅱ型膜蛋白,通过与其特异性死亡受体(DR4, DR5)结合而激活凋亡信号传导途径,从而诱导肿瘤细胞凋亡。TRAIL已被证实对白血病有杀伤作用而对正常的宿主细胞无毒副作用,但是TRAIL的耐药对治疗带来了巨大的挑战,影响了其临床应用。寻找能增强TRAIL诱导白血病细胞凋亡的药物可以提高其潜在的临床应用。白花丹醌(Plumbagin)是中药白花丹的主要活性成分,具有广泛的药理活性,包括抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用。研究发现,白花丹醌也具有明显的抗肿瘤作用,能够抑制K562、Raji、Jurkat、NB4等白血病细胞株以及前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和宫颈癌等实体瘤细胞株的生长和增殖,但目前未见白花丹醌联合TRAIL对白血病细胞作用的报道。伴t(8；21)急性髓性白血病患者预后相对良好,但复发和耐药仍然威胁患者长期生存。Kasumi 1是培养自人t(8；21)急性髓系白血病患者的细胞株,本研究旨在探讨TRAIL及其联合白花丹醌体外诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用,为此类患者的治疗寻找新的治疗方法。第一部分白花丹醌增强rsTRAIL诱导的Kasumi-1细胞凋亡目的：观察白花丹醌、rsTRAIL单独及其联合体外诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。方法：采用Wright染色法观察细胞凋亡,采用WST-8 (CCK-8)比色法测定rsTRAIL单用、白花丹醌单用和二者联合应用对Kasumi-1细胞的生长抑制率；用流式细胞术、TUNEL法观察并且检测凋亡率。结果：(1)白花丹醌和rsTRAIL单用均可抑制Kasumi-1细胞的生长,联合应用可增加对Kasumi-1细胞的生长抑制率且呈时间和剂量依赖性(P<0.05)。(2) rsTRAIL (100ng/mL)和白花丹醌(2μmol/L)单用及其联合使用诱导Kasumi-1细胞Annexin V阳性细胞百分率分别为(27.7±2.9)%、(25.6±3.1)%和(52.1±3.3)%。(3) TUNEL法检测发现联合应用组较单用组凋亡细胞显著增多。结论：白花丹醌具有增强TRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用。第二部分白花丹醌增强rsTRAIL对Kasumi-1细胞诱导凋亡的机制研究目的：探讨白花丹醌、rsTRAIL单独及其联合体外诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用机制。方法：采用酶标仪检测白花丹醌作用后细胞内GSH含量变化；采用实时定量PCR检测白花丹醌作用后DR4、DR5基因水平变化；流式细胞仪检测白花丹醌作用后细胞膜表面DR4、DR5蛋白水平表达变化；Western blotting法检测单独应用及联合应用后DR5、caspase-3、caspase-8、caspase-9, Bcl-2, Bid, Bax及c-FLIP的变化；DR5的中和性抗体阻断后观察细胞凋亡率；NAC作用后观察细胞凋亡率及凋亡蛋白DR5、Bax、c-FLIP的表达变化。结果：(1)白花丹醌可以降低细胞内GSH的含量。(2)实时定量PCR检测发现白花丹醌可以上调DR5的表达。(3)流式细胞仪检测发现白花丹醌可以上调细胞膜DR5的表达。(4)Western blotting发现白花丹醌单独作用及其联合rsTRAIL应用时上调DR5、Bax、激活caspase-8和下调c-FLIP表达。(5)DR5的中和性抗体可以明显阻断TRAIL诱导的细胞凋亡及阻断白花丹醌的增强TRAIL凋亡作用。(6)NAC可以明显阻断白花丹醌诱导的凋亡,并且可以抑制白花丹醌上调DR5、Bax和下调c-FLIP的作用。结论：白花丹醌具有增强TRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡的作用,其机制与DR5上调、caspase-8激活和c-FLIP下调有关,白花丹醌上调DR5、Bax和下调cFLIP的作用与ROS激活相关。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
英文缩写词表  8-10
前言  10-11
第一部分 白花丹醌增强rsTRAIL诱导Kasumi-1细胞凋亡  11-20
  1、材料和方法  11-13
  2、实验结果  13-18
  3、讨论  18-19
  4、小结  19-20
第二部分 白花丹醌增强rsTRAIL对Kasumi-1细胞诱导凋亡的机制研究  20-42
  1、材料和方法  20-29
  2、实验结果  29-40
  3、讨论  40-41
  4、小结  41-42
参考文献  42-45
综述  45-69
  参考文献  61-69
发表的论文  69-70
致谢  70-71

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