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VEGF基因转染人脐带间充质干细胞向神经样细胞诱导分化的研究

作　者: 马跃东
导　师: 李德华
学　校: 辽宁医学院
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 人脐带间充质干细胞 VEGF 转染神经样细胞诱导
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的将血管内皮生长因子基因(vascular endothelial growth factor,VEGF)转染到人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUCMSCs),检测VEGF转染后的人脐带间充质干细胞向神经样细胞诱导分化能力的变化。方法将纯化的第4代hUCMSCs分为四组,常规培养的细胞组;不转染质粒但进行转染实验组;转染pEGFP-N3质粒组;转染GFP-VEGF质粒组,用Lipofectamine(多阴离子转染脂质体)法,将克隆入真核表达载体pEGFP-N3中的VEGF基因转染入hUCMSCs。然后用Real-time PCR检测VEGF基因表达,进行相对表达量分析。Western blot检测VEGF蛋白表达,以GAPDH作为内参,进行蛋白相对表达量分析,观察VEGF基因的表达对hUCMSCs的影响。用β-巯基乙醇为诱导剂的定向诱导法将转染后的hUCMSCs定向诱导成神经样细胞,并且从细胞形态学观察和免疫组化神经标记物检测(神经元特异性标志NSE、神经干细胞标记物神经巢蛋白Nestin、星形胶质细胞特异性标志GFAP的检测)的方法来观察转染后的hUCMSCs向神经样细胞诱导能力的变化,评价VEGF基因转染对hUCMSCs诱导为神经样细胞能力的影响。结果1.RT-PCR结果显示,VEGF基因在hUCMSCs-VEGF细胞中的表达量与其他三组细胞有显著差异(P<0.01),而未转染细胞,空转染细胞,转化空质粒细胞相比较,无明显差异。2. Western Blot检测结果显示,未转染细胞,空转染细胞,转化空质粒细胞,转染VEGF细胞中的VEGF蛋白表达量有明显变化,未转染细胞,空转染细胞,转化空质粒细胞,转染VEGF细胞中VEGF的表达量明显上升(P<0.01)。3.诱导后细胞形态学观察利用β-巯基乙醇为诱导剂的定向诱导法将转染后的hUCMSCs定向诱导成神经样细胞,未诱导细胞呈长梭形或成纤维细胞样,诱导后细胞形态出现明显变化,细胞收缩,逐渐向神经细胞转化,诱导6h后,多数细胞诱导为典型的神经样细胞,诱导24h后细胞收缩为锥形,三角形或者不规则形,折光性好,有些长突起末端形成长锥样及丝状。4.通过免疫组化实验,鉴定诱导分化出来的神经样细胞,分别进行了神经元特异性标志NSE、神经干细胞标记物神经巢蛋白Nestin和星形胶质细胞特异性标志GFAP的检测,发现NSE和Nestin染色有阳性结果,有荧光, GFAP染色和对照组无阳性结果,定量计数分析,NSE阳性的细胞约为(43.25±4.1)%,Nestin阳性的细胞约为(38.63±3.6)%。结论VEGF基因导入hUCMSCs,可以稳定表达,诱导后hUCMSCs-VEGF出现明显神经样细胞变化,并且转染了VEGF的hUCMSCs向神经样细胞诱导分化的能力未受到明显影响。

全文目录

摘要  4-6
英文摘要  6-8
英文缩略语表  8-9
前言  9-10
实验材料与方法  10-16
实验结果  16-20
讨论  20-22
结论  22-23
本研究创新性的自我评价  23-24
参考文献  24-27
附图  27-28
文献综述  28-38
  参考文献  34-38
在学期间科研成绩  38-39
致谢  39-40
个人简介  40-41

VEGF基因转染人脐带间充质干细胞向神经样细胞诱导分化的研究

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