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嗜硫性磁性微球特异性分离人血清免疫球蛋白G

作　者: 徐华明
导　师: 钱浩
学　校: 华侨大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 细乳液聚合磁性复合微球免疫球蛋白G(IgG) 2-巯基烟酸分离提纯工艺优化
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

随着抗体免疫技术广泛应用在生物化学、生物医药等生产领域,人们对免疫抗体的提纯效率、纯度、成本、活性等方面也提出了更高的要求。由于传统的纯化方法分离效率低、操作复杂、分离周期较长、生产成本高、生物活性损失较大,因此,开发一种快速、高效、简易、低成本制备高纯度免疫球蛋白的方法和工艺成为各国学者关注的热点。本文采用细乳液聚合技术制备了PS-Fe3O4磁性复合微球,通过偶联恰当的特征配合基,实现了对免疫球蛋白G的特异性识别,利用磁分离技术,直接从人血清中分离、纯化人体免疫球蛋白G。在分离过程中,主要讨论了血清与磁性微球的比例、吸附溶液和解吸附溶液的pH值、解吸附溶液的总体积以及离子强度变化、吸附和解吸附的时间变化等因素对分离的影响,并通过高效液相排阻色谱法(HPSEC)和BCA试剂盒测定蛋白法等分别进行了定性和定量分析,证明了此方法的可行性与可靠性,为分离纯化IgG提供了一种新的方法。主要研究结果如下:1.用化学共沉淀法制备了超顺磁性、表面亲油性的Fe3O4磁流体,其平均粒径小于17.7nm;通过细乳液聚合法实现苯乙烯单体对磁粒子的有效包裹,制备了平均粒径为120nm、分散均匀的磁性聚合物微球,其磁含量大于20%,饱和磁强度达到32.3emu/g。通过高分辨透射电镜证实了合成的磁性聚合微球为核壳式结构。2.在合成磁性微球过程中,引入酯官能团(-OOC2H5),因此在磁球表面可以修饰一定浓度的配体(2-巯基烟酸),实现磁性微球对免疫球蛋白G(IgG)的特异性识别与分离,分离效果显著。3.研究了磁球分离血清的各种影响因素,结果表明当配基的浓度为0.232mmol/g时,其适宜的范围是:血清与磁性微球的适合比例为1.0~1.67mL/g、吸附溶液的pH值为6.0~7.5、解吸液的pH值为12~13.5、吸附以及解吸附所需时间仅为5min、解吸溶液的体积为15~25mL、解吸溶液可适当添加0.5mol/L的Cl—溶液来促进解吸附。4.在磁性微球对血清中的IgG进行批量分离中,所提纯的IgG生物活性高、纯度较高,而且在整个分离工艺中,磁性微球技术表现出分离效率高、分离周期短、分离条件温和、操作简便等优点,为高效、高纯度、高活性分离提纯免疫球蛋白G提供了一种新的方法,在大规模、工业化生产方面具有一定的潜力。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
第一章绪论  14-46
  1.1 概述  14-15
  1.2 免疫球蛋白的结构、功能及常用的分离纯化方法  15-18
    1.2.1 免疫球蛋白的组成  15-16
    1.2.2 免疫球蛋白G 的结构  16-17
    1.2.3 IgG 的生物学活性  17
    1.2.4 IgG 的生理功能  17-18
  1.3 免疫球蛋白G 的分离与纯化的常用方法  18-30
    1.3.1 沉析法  19-22
      1.3.1.1 盐析法  19-20
      1.3.1.2 有机溶剂沉析法  20-21
      1.3.1.3 正辛酸法  21-22
    1.3.2 色谱分离技术  22-28
      1.3.2.1 凝胶色谱法  22-23
      1.3.2.2 离子交换色谱法  23-24
      1.3.2.3 疏水色谱法  24-25
      1.3.2.4 亲和色谱法  25-26
      1.3.2.5 A 蛋白亲和层析法  26
      1.3.2.6 嗜硫色谱  26-28
    1.3.3 电泳分离法  28
    1.3.4 膜分离方法  28-29
    1.3.5 其他方法  29-30
  1.4 磁性微球的制备  30-37
    1.4.1 磁性聚合物微球的分类  31
    1.4.2 磁性聚合物微球的制备  31-37
      1.4.2.1 包埋法  31-32
      1.4.2.2 化学转化法（原位法)  32-33
      1.4.2.3 单体聚合法  33-37
        1.4.2.3.1 悬浮聚合  33-34
        1.4.2.3.2 分散聚合法  34-35
        1.4.2.3.3 乳液聚合法  35-37
  1.5 本文的研究意义和目的  37-38
  1.6 本文的主要创新点  38-39
  参考文献  39-46
第二章实验部分  46-59
  2.1 化学试剂和仪器设备  46-49
    2.1.1 化学试剂  46-47
    2.1.2 仪器及设备  47-49
  2.2 实验方法  49-57
    2.2.1 化学试剂的预处理  49
    2.2.2 共沉淀法合成亲油性的磁性粒子  49
    2.2.3 细乳液法制备磁性微球  49-50
    2.2.4 磁球的醇解  50-51
    2.2.5 磁球的表面修饰  51
    2.2.6 偶联磁球对人体血清的分离  51-52
    2.2.7 SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳  52
    2.2.8 血清中各蛋白含量的测定  52-55
      2.2.8.1 基本原理  52-53
      2.2.8.2 蛋白含量的测定  53
      2.2.8.3 标准曲线的绘制  53-55
    2.2.9 高效液相色谱对蛋白的定性分析  55-57
  参考文献  57-59
第三章细乳液法制备 PS-Fe_3O_4磁性复合微球  59-75
  3.1 磁性无机微粒的选择  59-61
  3.2 磁性无机微粒的制备  61
  3.3 磁粒子的结构表征  61-64
  3.4 细乳液聚合法制备磁性复合微球  64-66
  3.5 磁性复合微球的制备以及结构表征  66-72
  3.6 本章小结  72-73
  参考文献  73-75
第四章人血清中免疫球蛋白 G（IgG）的分离  75-107
  4.1 功能性配基的选择  75-76
  4.2 磁性聚合微球的特点以及表征  76-79
  4.3 人血清中免疫球蛋白G（IgG）  79-81
  4.4 利用磁性微球技术特异性分离人血清IgG 的影响因素  81-104
    4.4.1 磁球表面活性配基的浓度对分离过程的影响  81-84
    4.4.2 血清和磁球的比例变化对分离的影响  84-90
    4.4.3 吸附时间变化对分离的影响  90-92
    4.4.4 解吸附时间变化对分离的影响  92-95
    4.4.5 吸附溶液pH 值的变化对分离的影响  95-99
    4.4.6 解吸附溶液离子强度和pH 值的变化对分离的影响  99-100
    4.4.7 解吸附溶液体积的变化对分离的影响  100-103
    4.4.8 (NH_4)_2SO_4 水溶性盐对分离的影响  103-104
  4.5 本章小结  104-106
  参考文献  106-107
第五章利用磁性微球技术大量分离人血清免疫球蛋白 G  107-126
  5.1 活化的磁性微球的表征  107-110
    5.1.1 热失重分析（TGA）  107-108
    5.1.2 红外谱图分析(FTIR)  108-109
    5.1.3 活化磁性聚合微球的元素分析  109-110
  5.2 人血清总蛋白和IgG 的浓度的测定  110
  5.3 磁性微球对血清的分离  110-121
    5.3.1 Cl-对解吸附的影响  110-115
    5.3.2 NaOH 对解吸附的影响  115-118
    5.3.3 磁性微球对血清的大批量分离  118-121
    5.3.4 IgG 生物活性的测试  121
  5.4 活化磁球的重复使用  121-125
  5.5 本章小结  125-126
第六章结论  126-128
附录:攻读硕士学位期间发表的论文  128-129
致谢  129

嗜硫性磁性微球特异性分离人血清免疫球蛋白G

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