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建立LCM分离精子细胞的DNA检测方法及其法医学应用

作　者: 刘芳
导　师: 刘雅诚
学　校: 山西医科大学
专　业: 法医学
关键词: 法医物证学精子混合斑激光捕获显微切割技术（LCM）低拷贝数短串联重复序列
分类号: D919
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的为了提高混合斑中精子细胞的检测成功率，建立一种能够有效分离混合斑中少量精子细胞并获得单一男性DNA分型的分离检测方法十分必要。本课题旨在建立一种用激光捕获显微切割技术（LCM）分离精子细胞的DNA检测方法；用建立的方法对5个个体的精子DNA进行检测，以比较这种方法在5个个体间是否有差异；并用建立的方法对低拷贝数进行检测；对利用LCM分离不同比例混合斑中的精子细胞并检测得到单一男性分型的能力进行评估，以期让LCM在强奸案件中发挥重大的作用。方法用LCM捕获同一个体的精子细胞，分为两组，分别用两种染色剂（苏木素和四碘荧光红）染色，提取和扩增方法一致，捕获400个精子细胞，每组进行3次平行试验，对两种染色剂染色的精子细胞的基因座检出率进行比较，选择一种对精子细胞DNA检测影响小的染色剂；用LCM捕获苏木素染色的同一个体的精子细胞，分为3组，各400个精子细胞，分别用三种不同的试剂盒(DNA IQ^TMSystem，QIAamp○R Mini Extraction Kit和Picopure^TM DNA Extraction Kit)对精子细胞进行提取，进行同样条件的扩增，每种提取方法进行3次平行实验，通过比较基因座检出率来选择一种能够有效提取LCM分离的精子细胞DNA的提取方法；用LCM捕获5个不同个体的精子细胞各400个，用建立的染色方法和提取方法及同一种扩增条件对精子DNA进行检测，比较用建立的方法检测5个不同个体是否有差异；把标准9947A稀释成0.1ng/μL、0.075 ng/μL、0.05ng/μL、0.025ng/μL、0.01ng/μL，分别用28、30、32、34个扩增循环数进行扩增，得出适合低拷贝数DNA的扩增循环数；利用建立的适合LCM分离精子细胞的染色和提取方法，并增加循环数到34个循环，对30、20、10、5、4、3个精子细胞进行检测；人为配制9个不同比例的精子细胞-阴道上皮细胞混合液，并涂于玻片上，用LCM分离玻片上混合斑中的精子细胞（数量均少于200个）并进行DNA检测，得出检出率，以评价LCM技术方法在分离混合斑中少量精子细胞并得到单一男性分型的能力。结果苏木素染色后和四碘荧光红染色后的基因座检出率之间的差异明显具有统计学意义，用苏木素染色的精子细胞提取后可得到全部的基因座分型，而四碘荧光红染色的精子细胞未得到任何分型；在3种试剂盒的DNA提取方法中，DNAIQ^TM System试剂盒的提取效果最好；比较检测的5个个体之间的精子细胞DNASTR基因座检出率，统计学分析用这种方法检测5个个体精子细胞DNA的基因座检出率无明显差异；用建立的方法对低拷贝数进行检测，30、20、10、4个精子细胞可得到全部基因座分型，5个精子细胞有丢失等位基因现象，3个精子细胞有丢失等位基因和非特性扩增的现象；用LCM捕获9个不同比例的混合斑中的精子细胞（数量均﹤200个）并进行DNA检测，其检出率为88.9﹪，且均为单一的男性分型。最后将建立的LCM技术方法应用于实际案例，并取得成功。结论本研究成功建立了一种适合激光捕获显微切割技术（LCM）分离精子细胞的细胞染色方法和DNA提取方法，并评价了LCM分离混合斑中精子细胞并检测得到单一男性分型的能力，为LCM技术在法医学实际案例中的应用提供了方法学基础。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-11
第一部分建立LCM 分离精子细胞的DNA 检测方法  11-32
  1 材料与方法  11-15
  2 结果  15-27
  3 讨论  27-32
第二部分 LCM 分离玻片上混合斑中的精子细胞及其在强奸案件中的应用  32-41
  1 材料和方法  32-34
  2 结果  34-37
  3 案例应用  37
  4 讨论  37-40
  5 小结  40-41
参考文献  41-43
综述  43-49
  一、LCM 技术的介绍  43-44
  二、LCM 技术在法医学中的应用研究  44-46
  三、小结  46-47
  参考文献  47-49
作者简历  49-50
致谢  50

建立LCM分离精子细胞的DNA检测方法及其法医学应用

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