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β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的诱导表达

作　者: 李丽娟
导　师: 赵林果
学　校: 南京林业大学
专　业: 生物化工
关键词: 重组毕赤酵母 β-葡萄糖苷酶表达条件优化高密度发酵酵母菌的综合利用
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

论文以获得高活力外源β-葡萄糖苷酶及开发利用发酵液残渣酵母为目标,以基因工程菌GS115 bgl1为菌株,研究了β-葡萄糖苷酶诱导表达的适宜条件及其酶学特性;在此基础上,进行了5L发酵罐放大发酵实验;并就如何利用发酵液中的酵母进行了探索性的研究。结果表明:基因工程菌GS115 bgl1诱导表达β-葡萄糖苷酶的适宜条件为:FM21培养基的pH为6.0,组氮酸和PTM1的加入量分别为0.1%和0.4%,接种量为6%,每24h添加一次1%甲醇。此外,添加硫酸铵,磷酸二氢钾,Tween80,油酸可提高β-葡萄糖苷酶的酶活。发酵罐的高密度发酵结果表明,甲醇诱导72h后,β-葡萄糖苷酶活可达145 IU/mL,蛋白表达量可达7500mg/L。与摇瓶相比,最高酶活及胞外蛋白表达量分别提高了1.87倍和1.79倍,是出发菌株黑曲霉产酶能力的33.6倍,实现了β-葡萄糖苷酶的高效表达。利用浓盐法提取发酵液残渣酵母中的核酸时,核酸得率为1.56%,提取率为2.71%,纯度达97.2%,分子量在19392bp左右。利用碱法提取发酵液残渣酵母中的多糖时,可得到高附加值的β-1,3-D.葡聚糖和甘露聚糖两种多糖。通过对发酵液中的酵母进行综合利用,既减少了废酵母的大量排放对环境的污染,同时也为核糖核酸及多糖提供了新的来源。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-8
前言  8-10
  1.课题研究的背景及意义  8
  2.课题研究的目的  8
  3.本论文主要研究内容  8-9
  4.本论文的主要思路创新  9
  5.下一步研究重点  9-10
第一章文献综述  10-23
  1.1 β-葡萄糖苷酶的研究现状  10-13
    1.1.1 β-葡萄糖苷酶的来源  10
    1.1.2 β-葡萄糖苷酶在细胞中的分布  10-11
    1.1.3 β-葡萄糖苷酶的理化性质  11
    1.1.4 β-葡萄糖苷酶活性测定  11-12
    1.1.5 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制  12-13
    1.1.6 β-葡萄糖苷酶的生物学功能  13
  1.2 β-葡萄糖苷酶的应用  13-14
    1.2.1 水解纤维素  13
    1.2.2 生产低聚龙胆糖  13
    1.2.3 在脱苦中的应用  13
    1.2.4 作为风味酶  13-14
  1.3 β-葡萄糖苷酶的制备  14-15
  1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的生物学特点  15-16
  1.5 高密度培养的概述  16-18
    1.5.1 定义  16-17
    1.5.2 影响高密度培养的因素  17-18
  1.6 酵母的开发利用  18-23
    1.6.1 酵母核酸的研究进展  18
    1.6.2 RNA的应用  18-19
    1.6.3 谷胱甘肽的功能  19
    1.6.4 谷胱甘肽的应用  19-21
    1.6.5 酵母细胞壁多糖概述  21-22
    1.6.6 酵母细胞壁多糖的应用  22-23
第二章基因工程菌高效表达的条件优化  23-41
  2.1 试验材料与方法  23-27
    2.1.1 材料  23-24
    2.1.2 试验操作及方法  24-27
  2.2 结果与讨论:  27-40
    2.2.1 初始pH对β-葡萄糖苷酶表达的影响  27-29
    2.2.2 组氨酸加量对β-葡萄糖苷酶表达的影响  29-30
    2.2.3 甲醇添加量对β-葡萄糖苷酶表达的影响  30-31
    2.2.4 甲醇添加时间对β-葡萄糖苷酶表达的影响  31-32
    2.2.5 接种量对诱导表达β-葡萄糖苷酶的影响  32
    2.2.6 PTM1加入量对β-葡萄糖苷酶诱导表达的影响  32-33
    2.2.7 硫酸铵浓度对β-葡萄糖苷酶表达量的影响  33-34
    2.2.8 磷酸氢二钾对β-葡萄糖苷酶诱导表达的影响  34-35
    2.2.9 Tween80对β-葡萄糖苷酶诱导表达的影响  35
    2.2.10 油酸对β-葡萄糖苷酶诱导表达的影响  35-36
    2.2.11 发酵过程中酵母的形态变化  36-37
    2.2.12 酶学性质  37-40
  2.3 小结与讨论  40-41
第三章重组毕赤酵母在发酵罐中高密度发酵  41-50
  3.1 材料和方法  41-43
    3.1.1 材料  41-42
    3.1.2 方法  42-43
  3.2 结果与讨论  43-49
    3.2.1 高密度发酵的结果  43-46
    3.2.2 高密度发酵的过程分析  46-49
  3.3 小结  49-50
第四章发酵液中酵母的开发利用  50-60
  4.1 材料  50
    4.1.1 原料  50
    4.1.2 主要试剂  50
    4.1.3 主要实验设备  50
  4.2 方法  50-53
    4.2.1 酵母的预处理:  50-51
    4.2.2 发酵液及水洗液中甲醇含量的测定  51
    4.2.3 核酸的提取  51-52
    4.2.4 GSH的提取  52-53
    4.2.5 多糖的提取  53
  4.3 结果与分析  53-59
    4.3.1 发酵液及水洗酵母上清液中甲醇浓度测定结果  53-54
    4.3.2 碱法提取核酸的结果  54
    4.3.3 核酸纯度紫外鉴定结果  54-55
    4.3.4 核酸电泳结果  55
    4.3.5 GSH的含量  55
    4.3.6 β-1,3-D-葡聚糖的含量  55
    4.3.7 β-1,3-D-葡聚糖纯度鉴定结果  55-57
    4.3.8 甘露聚糖的含量及收率  57
    4.3.9 甘露聚糖的纯度鉴定结果  57-58
    4.3.10 单糖薄层层析的结果  58-59
  4.4 小结与讨论  59-60
结论与展望  60-62
参考文献  62-68
详细摘要  68-70

β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母中的诱导表达

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