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犬MC4R基因的原核表达与纯化

作　者: 贺宝军
导　师: 巴彩凤
学　校: 辽宁医学院
专　业: 免疫学
关键词: 犬 MC4R MC4R N端原核表达纯化
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 18次
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内容摘要

目的获得用于制备兔抗犬 MC4R抗体的犬MC4R蛋白和MC4R N端蛋白抗原。方法1、用PCR方法扩增犬MC4R的全长编码序列,回收纯化后,与pMD18-T载体连接,构建pMD18-T/cMC4R重组体,经电泳、酶切、测序等方法鉴定;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定正确的pMD18-T/cMC4R质粒,获得具有粘性末端的犬MC4R序列,将其亚克隆至原核表达载体pET30a(+),构建重组体pET30a(+)/cMC4R。2、用PCR方法扩增犬MC4R N端基因序列,双酶切N端基因序列和原核表达载体pET30a(+)连接,构建重组载体pET30a(+)/N-cMC4R。3、将鉴定正确的重组载体pET30a(+)/cMC4R和pET30a(+)/N-cMC4R分别转化于E. coli Transetta(DE3),IPTG诱导表达后,获得His-MC4R融合蛋白及N端融合蛋白(His-N-MC4R);用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。4、N端融合蛋白经Ni-NAT亲和层析柱进行分离纯化。结果1、经电泳、酶切、测序等方法鉴定,犬MC4R目的序列成功克隆至pMD18-T载体和原核表达载体pET30a(+)中,并且表达读码框正确。2、成功地实现了重组体pET30a(+)/cMC4R和pET30a(+)/N-cMC4R分别在E.coli Transetta(DE3)中的表达。SDS-PAGE分析表明:重组表达载体pET30a(+)/cMC4R表达产物的相对分子质量约为37 kDa ,pET30a(+)/N-cMC4R表达产物的相对分子量约为16 KDa,大小都与预期相符;Western blot结果证实这两种融合蛋白均能与His抗体特异性结合。3、N端蛋白经Ni-NAT亲和层析柱纯化后,融合蛋白纯度在95 %左右。结论成功构建了原核表达重组体pET30a(+)/cMC4R和pET30a(+)/N-cMC4R,实现了MC4R全长编码基因和N端基因在E.coli Transetta(DE3)中的诱导表达;Western blot分别检测证实诱导表达的蛋白是His-MC4R融合蛋白、His-N端融合蛋白;成功实现了犬MC4R His-N端融合蛋白的分离纯化。

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-8
英文缩略语  8-9
前言  9-11
实验材料  11-13
实验一犬 MC4R基因的原核表达  13-22
  1. 实验方法  13-20
  2. 实验结果  20-22
实验二犬MC4R基因N端蛋白的表达与纯化  22-29
  1. 实验方法  22-27
  2. 实验结果  27-29
讨论  29-35
结论  35-36
本研究创新性的自我评价  36-37
参考文献  37-40
附录  40-52
  综述  40-49
    参考文献  46-49
  在学期间科研成绩  49-50
  致谢  50-51
  个人简介  51-52

犬MC4R基因的原核表达与纯化

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