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整合基因组和转录组分析识别鼻咽癌候选癌基因

作　者: 赵瑾
导　师: 姚开泰
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 鼻咽癌癌基因 PTHLH SNP芯片表达谱芯片
分类号: R739.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma,NPC）是一种上皮源性恶性肿瘤,绝大多数属于低分化鳞状细胞癌,恶性程度高。鼻咽癌的地区分布极不均衡,在我国南方及东南亚一带发病率较高,其中又以广东省的发病率最高,故又有“广东瘤”之称。鼻咽癌发病在各个年龄均可见,尤其是40-60岁年龄段高发,而且早期症状不明显。临床上以放疗为主,但五年的生存率仍然徘徊在50-60%,因此,鼻咽癌仍然是一个亟待解决的难题。流行病学研究表明,鼻咽癌的发生与EB病毒（Epstein-Barr Virus）感染、遗传因素及某些环境和饮食因素等有密切关系,在这些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮细胞发生遗传变异事件和表观遗传学改变的不断积累,最终引起细胞的恶性转化,导致鼻咽癌的发生。肿瘤发病是一个多阶段,多途径的过程,涉及多个癌基因和抑癌基因的异常活性。而在鼻咽癌的发生发展,其癌基因和抑癌基因同样起关键作用。迄今为止,鼻咽癌抑癌基因的研究发现已有重大进展,RASSF1A、BLU、BRD7、DAPK1、DLC1等30多个基因已在基因表达沉默后对细胞生物学行为的影响等方面就被证实具有鼻咽癌抑癌基因的潜质,而且发现其分子机理主要为基因的甲基化。但鼻咽癌癌基因的研究则相对滞后,虽然已有BCL2、CCND1、EGFR、TP73L、EVI1、HER2、HRAS、NRAS、STAT1、STAT2、INT2/FGF3,MDM2、MYC、PIK3CA等基因由于在鼻咽癌中扩增或过表达而被推测为鼻咽癌潜在的癌基因,但是鲜有报道过表达后对细胞生物学行为的影响,更没有体内研究的报道。因此,寻找鼻咽癌的抑癌基因尤其是癌基因,并研究这些基因在鼻咽癌发生发展中的变化和作用机制对于揭示鼻咽癌的发生发展机理有重要意义。基因组的改变促使癌基因和抑癌基因表达水平的失调,这种变化的积累与肿瘤的发生演进密切相关。目前,根据基因拷贝数增加以及过表达来筛选染色体扩增子中的候选癌基因已经成为寻找关键癌基因的重要途径。Redon等人根据染色体3q在头颈部肿瘤的高频率扩增（＞50%）,采用基于DNA微阵列的基因组和转录组方法探测候选的癌基因,结果发现了定位于3q25.3的Cyclin L基因在舌癌细胞株中基因拷贝数有不同程度扩增而且表达水平与基因拷贝数呈正相关,说明该基因是3q25.3在头颈部肿瘤中扩增的靶基因。进一步研究发现Cyclin L基因在20例头颈部肿瘤及配对正常组织中的表达具有明显的差异性,而且在高分化肿瘤中过表达而在低分化肿瘤中正常表达;由于该基因具有促进细胞周期从G0期进入G1期的功能,因此作者推测Cyclin L基因是头颈部肿瘤的候选癌基因并认为它促进高分化头颈部肿瘤细胞增生。随着生物技术的发展,单核苷酸多态性阵列（SNP array）能够分析肿瘤细胞中的DNA拷贝数扩增和杂合性缺失事件,能够精确的对全基因组中的遗传变异进行精确作图,为探测新的候选基因提供一个有希望的突破点。2003年以来Affymetrix公司不断推出了Human Mapping 10k、100k、500k SNP芯片,相比较于传统的CGH,核型分析以及后来的array-based CGH,500K SNP芯片SNP位点两侧10kb范围内的序列覆盖85%的全基因组序列,可以发现不小于0.02-0.1Mb的染色体畸变,而且出现了许多成熟的基于该类芯片数据拷贝数分析软件,例如斯坦福大学开发的DNA-Chip Analyzer（dChip）dchip软件和Affymetrix GTYPE4.1软件等,为后续实验研究提供技术支持。那么SNP芯片到底能不能检测肿瘤基因组拷贝数的改变昵?2004年,Cancer Research一篇文献通过三个步骤证明了SNP芯片是完全可以分析肿瘤基因组的遗传变异事件。首先,他们收集了5个细胞株,这5个细胞株是染色体核型已知的常染色体为正常的二倍体,而X染色体发生1-5倍体拷贝数的改变,通过SNP芯片检测其结果99.2%与已知的细胞株的染色体核型相符合;接下来,又通过SNP芯片检测染色体变异区域比较明确的小细胞肺癌细胞株NCI-H2171基因组拷贝数的变化情况,又对这些关键染色体区域基因通过荧光定量RT-PCR技术进行验证,其结果也与已知结果相稳合。接着,又应用SNP芯片,cDNA阵列、BAC克隆阵列来检测同一种乳腺癌细胞株BT474染色体拷贝数的变异,发现三种方法检测染色体变异的趋势基本一致,并且SNP芯片的检测结果更加精确,因此SNP芯片是可以检测基因组拷贝数变化的。这就为后续实验提供了理论依据。目前研究表明,结合SNP芯片和表达谱芯片可以探测肿瘤候选靶基因,而且这种方法在多种肿瘤中都有应用。2005年,Levi A.Garraway等结合SNP芯片拷贝数分析和基因表达谱芯片分析成功发现了黑色素瘤中特异的既扩增又过表达关键性癌基因MITF,并通过实验证实了该基因在黑色素瘤发生发展起到关键性的作用。2007年,Harada T等利用代表11600 snp位点的微阵列检测27例胰腺导管腺癌（PDAC）基因组拷贝数的改变,发现1q,2,3,5,7p,8q,11,14q和17q（＞/=78%of cases）染色体的扩增,和1p,3p,6,9p,13q,14q,17p和18q（＞/=44%）染色体的缺失,又结合Ensembl public data,成功的发现PDAC中SKAP2/SCAP2基因（7p15.2）,在63%的样品中扩增,在67%的样品中过表达,并通过荧光原位杂交和原位RNA杂交实验证明了基因组拷贝数与基因表达水平之间的重要关系。随后,在前列腺癌、大肠癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、乳腺癌、和肝癌等多种肿瘤的细胞株中进行类似的分析,均有重要发现。2004年,本所黄仲曦博士收集了来自香港、台湾、湖南和广东等五个实验室发表的170例鼻咽癌比较基因组杂交（CGH）数据,采用Schaffer和Desper发明的两种利用比较基因杂交数据构建肿瘤发生发展的树模型方法,构建了鼻咽癌发生发展的树模型。该树模型还预测了12p12-11的扩增是鼻咽癌最高频率发生的时间,也被推测为鼻咽癌的早期早期事件。染色体12p的扩增在其它肿瘤也被认为是高频发生的事件。基于本课题组的前期研究,那么我们推测在鼻咽癌高频率扩增的区域12p12-11可能存在鼻咽癌关键性的候选癌基因。因此,我们拟利用250K SNP芯片检测已有的5个鼻咽癌细胞株和永生化的鼻咽上皮细胞株NP69,并利用获得的数据采用dChip软件进行基因组拷贝数分析,在结合鼻咽癌细胞株表达谱数据,建立一个包含拷贝数和表达值的NPC基因图谱,并筛选在染色体高拷贝扩增区域12p12-11鼻咽癌细胞中既扩增又过表达的候选基因,并通过荧光定量RT-PCR和免疫组化的方法对新的候选鼻咽癌癌基因进行初步试验验证,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础。（一）整合基因组和转录组识别鼻咽癌染色体12p12-11区域新的侯选癌基因采用Affymetrix公司250k的SNP芯片检测5个鼻咽癌细胞株（5-8F、6-10B、CNE1、CNE2和HONE1）和永生化鼻咽上皮细胞株NP69全基因组拷贝数的改变,采用包含54,675个探针的4个鼻咽癌细胞系（CNE1、CNE2、HONE1和NP69）Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0表达谱芯片检测鼻咽癌基因组拷贝数的改变和表达情况,建立一个包含拷贝数和表达值的NPC基因图谱,识别先前树模型提示的鼻咽癌高拷贝扩增区域12p12-11,发现既扩增又过表达的潜在癌基因PTHLH.。（二）鼻咽癌候选癌基因PTHLH拷贝数和表达特性的鉴定采用荧光定量RT-PCR的方法检测了5-8F、6-10B、CNE1、CNE2和HONE1等5种鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽上皮细胞株NP69中PTHLH的拷贝数的变异情况和表达情况,结果显示5种细胞株中PTHLH的拷贝数和表达差异均具有显著性（P＜0.05）。运用绝对定量的方法对6种鼻咽癌细胞系中PTHLH的拷贝数的改变与正常的二倍体胎盘组织Placenta相比较,结果发现PTHLH在5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1、NP69中的拷贝数均高于Placenta（P＜0.05）。运用2^-ΔΔCt法对6种鼻咽癌细胞株中PTHLH的表达水平与NP69相比较,结果发现PTHLH在5-8F、6-10B、CNE1、CNE2、HONE1中的表达水平均高于NP69（P＜0.05）。采用RT-PCR的方法检测PTHLH在17例鼻咽癌组织中的表达水平,结果显示PTHLH在64.7%的组织中表达。采用免疫组化的方法检测鼻咽癌组织和鼻咽炎组织中PTHLH的表达,PTHLH表达主要定位在细胞核,少数可见表达于细胞质。经统计分析,PTHLH的表达与患者的年龄、性别的相关性均统计学差异（P＞0.05）,但在鼻咽癌组织的的表达明显高于鼻咽炎组织（P＜0.05）。结论1.整合鼻咽癌细胞系SNP芯片和表达谱芯片分析能够检测肿瘤中的候选癌基因,采用这种方法建立一个包含拷贝数和表达值的NPC基因图谱。并且发现鼻咽癌树模型高拷贝扩增区域12p12-11中PTHLH基因在鼻咽癌细胞系中既扩增又过表达。2.荧光定量RT-PCR验证PTHLH在鼻咽癌细胞系中存在拷贝数的扩增并且表达上调,RT-PCR及免疫组化结果结果证明PTHLH在鼻咽癌组织的表达明显高于非癌鼻咽组织,提示了其是鼻咽癌的候选癌基因,可能参与了鼻咽癌的发病机制。

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