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刺槐高频再生体系的建立及转Bt Cry1A基因的初步研究

作　者: 肖硕
导　师: 洪华珠
学　校: 华中师范大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 刺槐高频再生体系农杆菌介导的基因转化 Btcry1A基因 GUS组织染色分析
分类号: S792.27
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

刺槐(Robinia pseudoacacia L.),为豆科Leguminosae刺槐属(Robinia L.)落叶乔木,原产北美。中国于1877年引入栽培,主要包括刺槐R.pseudoacaciaL.和毛刺槐R.hispida L.两种,常见于中部和东部,由于其生长迅速、木材坚韧、纹理细致、有弹性、耐水湿、抗腐朽、根系发达,具根瘤,有一定的抗旱、抗烟、耐盐碱能力(国家林业局国有林场和林木种苗工作总站,2001),现已成为华北、西北等地区优良的保持水土、防风固沙、改良土壤的优质树种,深受群众欢迎(荀守华等,2009)。刺槐还具有花香浓郁、抗逆性强、病虫害少、价格低等优点,且易于栽培、成活率高、绿化效果好,适宜于景观绿化与经济用途(张亚玲等,2009)。然而,近年来,生态环境等各方面的影响使刺槐也面临一些严重的病虫害:病害——紫纹羽病和烂皮病等;虫害——白蚁、叶蝉、蚧、小皱蝽(叶)、豆荚螟虫、麦蛾、小蜂(种子)等。而因为以下种种原因,刺槐的转基因工程研究进展较缓慢。其一,一直以来,木本植物的遗传转化成功几率都比较低,而刺槐为大型木本植物,基因组庞大,外源基因很难插入并表达,即使有少数转化成功的株系,在以后的继代培养中也容易发生基因丢失或基因沉默等现象,这是木本植物转基因研究中迄待解决的问题(荀守华等,2009);其二,刺槐的遗传转化工作缺乏再生频率高、重复性好的受体系统;其三,缺乏优良的目的基因的克隆和启动子的构建;其四,转化频率低、实验重复性差,没有形成第一代工程品种(郑进等,2005)。针对上述刺槐的广泛用途及其病虫害特点,更兼于豆科植物是被子植物第二大科,本实验展开了刺槐离体转化受体系统的建立及基因转化的研究,拟建立一个高效的刺槐转化受体系统,并进一步开展抗病虫害的转基因研究,旨在为刺槐及其他豆科植物的抗病虫害方面提供借鉴及良好的应用价值。本实验首先以生长良好的刺槐植株的带腋芽茎段为外植体,研究了在刺槐高频再生体系的建立过程中不同基本培养基、不同激素浓度及其配比对愈伤组织的诱导、芽的分化及生根的影响;然后在得到高频再生体系的基础上,通过农杆菌介导法转化Bt Cry1A抗虫基因,以GUS染色组织分析为依据探讨了影响转化效率的各种因素,建立了高效、可重复的基因转化体系,为刺槐目的基因的导入打下了基础。试验取得如下研究结果:1.建立了刺槐高频再生基因转化受体系统。在刺槐离体茎段为外植体诱导愈伤组织的过程中,芽的分化以MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.04mg/L+蔗糖30g/L+琼脂9g/L条件下分化率最高,每个外植体的平均分化芽数可达到7.3个;诱导生根以MS+NAA0.04mg/L+KT 0.05mg/L+蔗糖30g/L,效果最佳,生根率最高可达93.3,平均生根率达86.7%;在移栽生根苗时,先在温室中驯化炼苗15～20天后移入大田,成活率可达83%以上。2.以GUS染色检测为依据初步建立了刺槐高效遗传转化体系。以农杆菌菌株LBA4404介导Bt Cry1A基因的转化,首先确定了转化培养中最佳的抑菌素及其浓度和选择压:头孢霉素(Cef)400mg/L即可有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长;卡那霉素(Km)50mg/L为选择压较适宜。并进一步优化了转化体系:以离体茎段为外植体,预培养1-2天,OD值为0.5～0.7的农杆菌LBA4404菌液浸染外植体以8～10分钟为宜;共培养时间3～4天较适合;共培养培养基中添加AS 30mg/L,GUS+阳性发生率可达最高值。共培养后转入附加Cef 400mg/L的培养基中培养,15天后转入附加Km 50mg/L的培养基中筛选抗性植株。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
Ⅰ 前言  10-28
  1.植物转基因研究概述  10-22
    1.1 目的基因的类型  10-14
    1.2 目的基因的转化方法  14-15
    1.3 植物基因转化转化受体  15-18
    1.4 转基因植物的鉴定方法  18-20
    1.5 转基因植物的应用概况  20-22
  2.刺槐遗传转化研究进展  22-26
    2.1 刺槐的遗传转化受体研究进展  22-25
    2.2 刺槐的遗传转化  25-26
  3.本研究的目的与意义  26-28
Ⅱ 实验材料  28-33
  1.植物材料  28
  2.农杆菌  28-29
  3.培养基  29-31
    3.1 农杆菌用YEB培养基  29
    3.2 植物培养基  29-31
  4.药品  31
  5.溶液  31-33
    5.1 植物激素溶液的配置  31
    5.2 GUS组织染色液  31-33
Ⅲ 实验方法  33-37
  1.刺槐组织快繁体系的建立  33-34
    1.1 最佳基本培养基的确定  33
    1.2 激素对离体茎段分化丛生芽的影响  33
    1.3 生根培养  33-34
  2.刺槐基因转化受体系统的建立  34-37
    2.1 抑菌抗生素对农杆菌的抑制试验  34
    2.2 刺槐的抗生素敏感性试验  34
    2.3 选择培养基中卡拉霉素选择压的确定试验  34
    2.4 农杆菌介导的遗传转化方法  34-35
    2.5 GUS组织化学染色分析  35
    2.6 影响农杆菌转化刺槐效果的因素试验——转化体系的优化  35-37
Ⅳ 实验结果与分析  37-55
  1.刺槐组织快繁体系的建立  37-44
    1.1 最佳基本培养基的确立  37-38
    1.2 激素对离体茎段分化丛生芽的影响  38-41
    1.3 生根培养  41-44
  2.刺槐基因转化受体系统的建立  44-55
    2.1 抑菌抗生素对农杆菌的抑制实验  44-45
    2.2 抗生素对刺槐离体茎段分化丛生芽的影响试验  45-46
    2.3 选择培养基中卡拉霉素(Km)选择压的确定  46-47
    2.4 影响农杆菌转化刺槐效果的因素试验——转化体系的优化  47-55
Ⅴ 讨论与展望  55-59
  1.讨论  55-57
    1.1 刺槐遗传转化再生体系的建立  55
    1.2 关于转化效率评价指标的探讨  55-57
    1.3 关于Km选择嵌合体的讨论  57
  2.小结  57-58
  3.关于刺槐转基因工作的展望  58-59
参考文献  59-65
主要英文缩略词表  65-66
硕士期间的研究成果  66-67
致谢  67

刺槐高频再生体系的建立及转Bt Cry1A基因的初步研究

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