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解偶联蛋白2在肝细胞的表达及其与肝细胞脂肪变性关系的研究

作　者: 朱亚男
导　师: 王炳芳
学　校: 江苏大学
专　业: 内科学
关键词: 肝细胞解偶联蛋白2 非酒精性脂肪变甘油三酯 ATP ALT AST
分类号: R575
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:建立肝细胞脂肪变性的细胞模型,研究解偶联蛋白2在正常肝细胞及不同程度脂肪变的肝细胞中表达情况,探讨解偶联蛋白2与肝细胞脂肪变的关系及其对肝细胞能量代谢的影响。方法:将正常人肝细胞株HL-7702作为实验对象,用脂肪乳剂(临床静脉营养药物)培养肝细胞,使其发生不同程度的脂肪变,作为肝细胞脂肪变的模型。正常培养的细胞作为对照组,另设四组为模型组,其培养液内脂肪乳剂的浓度分别为0.5μl/ml、1.0μl/ml、2.0μl/ml及3.0z;μl/ml。分别干预24小时、48小时、72小时后,检测细胞活力以及细胞受损的情况(培养液中ALT、AST泄漏量),同时用油红O染色发生脂肪变的肝细胞,显示肝细胞内脂肪变的情况,并测定细胞内TG及ATP含量。应用RT-PCR技术检测细胞内UCP2mRNA表达水平,免役印迹检测UCP2蛋白的表达情况。结果:脂肪乳剂培养细胞48小时之内各组ALT、AST水平较之正常对照组无明显差异(p＞0.05),成功制备出NAFLD模型。油红O染色显示正常对照组则无明显脂滴堆积,而模型组肝细胞胞浆内出现大量脂滴,而且脂滴的量随着脂肪乳剂浓度的增加而不断增多。模型组细胞内甘油三脂(TG)含量明显高于正常组(p＜0.01),细胞内的ATP含量随着脂肪的不断堆积而减少(p＜0.05)。正常肝细胞内可以检测到UCP2mRNA表达,且随着脂肪乳剂浓度的不断增加,UCP2mRNA表达量也增加。模型组与正常对照组表达量相比,差异具有显著性(P＜0.01),模型组之间的表达量差异也具有统计学意义(P＜0.01)。正常组内未检测到UCP2蛋白,模型组中随着肝细胞脂肪变程度的加重,UCP2蛋白表达也增加(P＜0.05)结论:应用脂肪乳剂在合理的浓度和干预时间段内培养肝细胞,可以运用体外培养的方法成功地制备出NAFLD细胞模型。脂肪变性的肝细胞中UCP2表达较正常肝细胞增加,且与脂肪变程度呈正相关,与细胞内TG含量呈正相关,与细胞内的ATP含量呈负相关。UCP2的表达在蛋白质和核酸水平具有不一致性。UCP2对脂肪变的肝细胞无明显保护作用,甚至会加重细胞损伤。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一部分肝细胞非酒精性脂肪变模型的制备及细胞损伤情况的研究  14-27
  1.1 材料  15-16
    1.1.1 实验用肝细胞  15
    1.1.2 主要试剂  15
    1.1.3 主要仪器  15-16
    1.1.4 主要试剂配制  16
  1.2 方法  16-19
    1.2.1 肝细胞培养  16
    1.2.2 肝细胞生长曲线的绘制  16-17
    1.2.3 细胞活力的检测和油红0染色  17-18
      1.2.3.1 染色前细胞的处理  17
      1.2.3.2 细胞活力的检测-台盼蓝排斥实验  17-18
      1.2.3.3 细胞油红0染色  18
    1.2.4 细胞内TG、ATP及培养液中ALT、AST检测  18-19
      1.2.4.1 细胞内TG及ATP含量的检测  18-19
      1.2.4.2 培养液中AST及ALT含量的检测  19
  1.3 结果  19-24
    1.3.1 确定肝细胞对数生长期  19-20
    1.3.2 台盼蓝染色计数细胞活力  20-21
    1.3.3 细胞染色结果  21-23
      1.3.3.1 肉眼观察  21
      1.3.3.2 染色后观察  21-23
    1.3.4 生化指标的检测  23-24
      1.3.4.1 细胞内TG的检测结果  23
      1.3.4.2 细胞ALT、AST检测结果  23-24
  1.4 讨论  24-27
第二部分 UCP2在不同程度脂肪变的肝细胞中表达的研究  27-46
  2.1 材料与方法  29-31
    2.1.1 研究对象  29
    2.1.2 主要试剂  29-30
    2.1.3 主要试剂的配制  30-31
    2.1.4 主要仪器  31
  2.2 Western-blot检测细胞内UCP2的表达情况  31-33
    2.2.1 细胞培养及肝细胞脂肪变模型的建立  31
    2.2.2 总蛋白的提取和定量  31-32
    2.2.3 Western-blot的步骤:SDS—PAGE电泳  32
    2.2.4 转膜  32-33
    2.2.5 抗体孵育  33
    2.2.6 化学发光,显影,定影  33
  2.3 RNA的提取和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)  33-36
    2.3.1 提取总RNA  33-34
    2.3.2 RNA纯度的测定  34
    2.3.3 RT-PCR  34-36
      2.3.3.1 c-DNA的合成  34-35
      2.3.3.2 PCR反应  35-36
  2.4 统计学处理  36
  2.5 结果  36-39
    2.5.1 正常肝细胞及脂肪变肝细胞内UCP2蛋白表达情况  36-37
    2.5.2 正常肝细胞及脂肪变肝细胞UCP2mRNA表达情况  37-38
    2.5.3 肝细胞及肝癌细胞内UCP2mRNA表达情况比较  38-39
    2.5.4 肝细胞内ATP、TG含量与UCP2表达情况的相关性分析  39
  2.6 讨论  39-44
    2.6.1 NAFLD模型的建立  39-40
    2.6.2 正常细胞及脂肪变的肝细胞内UCP2表达的意义  40-43
    2.6.3 UCP2核酸和蛋白水平表达的不一致性  43-44
    2.6.4 不同细胞内UCP2表达的意义  44
  总结  44-46
第三部分综述:UCP2与非酒精性脂肪性肝病关系研究进展  46-52
  3.1 UCP2的作用  46-50
    3.1.1 UCP2的概述  46-47
    3.1.2 UCP2与脂肪酸的相互作用  47-48
    3.1.3 UCP2与反应性氧簇的生成  48-49
    3.1.4 UCP2与胰岛素的分泌  49-50
    3.1.5 UCP2与细胞凋亡  50
  3.2 UCP2与NAFLD的进展  50-51
    3.2.1 UCP2与脂肪性肝炎  50-51
    3.2.2 NAFLD时UCP2表达的细胞特异性  51
  3.3 结语  51-52
主要结论和展望  52-53
  4.1 主要结论  52
  4.2 展望  52-53
参考文献  53-58
中英文对照索引  58-59
致谢  59-60
攻读硕士学位期间发表的文章  60

解偶联蛋白2在肝细胞的表达及其与肝细胞脂肪变性关系的研究

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