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利用条件基因打靶技术研究新型锌指蛋白ZBTB20对软骨发育的调控作用

作　者: 周光迪
导　师: 章卫平；卢建
学　校: 第二军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 锌指蛋白 ZBTB20 单克隆抗体基因敲除生长板软骨发育
分类号: R68
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

锌指蛋白在个体的生长发育、细胞的增殖和分化、凋亡等生命活动过程中发挥重要作用。锌指蛋白ZBTB20是从人树突状细胞中发现的BTB/POZ锌指蛋白家族新成员,广泛表达于脑、脾脏、胰腺和肝脏等正常组织,但其生物学功能尚不清楚。本课题组利用基因打靶技术,成功建立了ZBTB20全身性基因敲除小鼠模型,发现其存在生长发育迟缓等严重表型,提示ZBTB20对个体生长发育具有重要调节作用,其机理有待深入研究。为此,本课题首先制备了ZBTB20的单克隆抗体,建立了检测人和鼠ZBTB20蛋白敏感度高、特异性强和稳定性好的检测分析方法。采用多肽抗原免疫和骨髓瘤细胞融合技术,通过四轮亚克隆筛选,最终得到一株稳定分泌ZBTB20单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过制备杂交瘤腹水、亲和层析柱纯化,成功制备了可用于ELISA、免疫组化、免疫印迹和免疫沉淀检测的抗ZBTB20单克隆抗体,命名为9A10。和已有的ZBTB20多克隆抗体相比,该单抗具有更高的检测灵敏度、特异性和稳定性,为深入研究ZBTB20的体内生物学功能提供了技术支持。利用该单克隆抗体,我们优化了免疫组化检测方法,并用此方法检测了ZBTB20在多种组织器官中的表达,发现ZBTB20在小鼠软骨细胞中特异性高表达,提示ZBTB20可能在软骨发育中起到调控作用;进一步通过定点交配取得野生型小鼠胚胎期及出生后各发育阶段腿骨标本并制样,对软骨细胞中ZBTB20的时空表达特征进行了系统分析。结果表明,ZBTB20于胚胎软骨发育的E14.5天开始表达,并特异表达于软骨生长板的肥大区。为研究ZBTB20在软骨发育过程中的调控作用,我们利用Cre/LoxP条件基因打靶技术,建立了ZBTB20的软骨细胞特异性基因敲除小鼠模型, Alcian Blue-Fast Red染色分析显示,软骨细胞特异性敲除ZBTB20导致软骨生长板中软骨细胞过度增生、形态结构发生紊乱,初生期软骨生长板肥大区变厚,成年后肥大区由规则板状结构变为不规则团状结构。上述结果表明,ZBTB20是软骨生长板肥大区特异表达的锌指蛋白,对软骨发育具有重要调节作用。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-7
缩略词表  7-8
第一部分抗 ZBTB20 单克隆抗体的制备与鉴定  8-32
  材料与方法  9-20
  实验结果  20-28
  讨论  28-29
  参考文献  29-32
第二部分软骨细胞发育过程中 ZBTB20 表达特征的分析  32-40
  材料与方法  33-36
  实验结果  36-37
  讨论  37-38
  参考文献  38-40
第三部分 ZBTB20 软骨细胞特异性基因敲除小鼠模型的建立及其软骨发育异常的初步研究  40-54
  材料与方法  40-45
  实验结果  45-51
  讨论  51-52
  参考文献  52-54
结论  54-55
综述软骨发育成骨过程及其调控  55-61
  参考文献  59-61
致谢  61

利用条件基因打靶技术研究新型锌指蛋白ZBTB20对软骨发育的调控作用

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