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逆转录酶抑制剂AZT对大鼠C6胶质瘤细胞作用的体外研究

作　者: 张景泽
导　师: 杨智勇；王廷华；丁鹏
学　校: 昆明医学院
专　业: 外科学
关键词: C6胶质瘤细胞 AZT 细胞凋亡细胞周期端粒酶抑制剂
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:观察端粒酶特异性抑制剂3’-叠氮-3’-脱氧胸腺核苷(3’-azido-2’3’-dideoxythymidine,AZT)对大鼠胶质瘤细胞系(C6细胞)的增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用,及其对细胞周期的影响。初步了解AZT抑制端粒酶活性后对恶性胶质瘤细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响,为以端粒酶为靶点进行恶性胶质瘤化学药物靶向治疗的可行性提供客观的实验依据。方法:将C6细胞按1-5×10~5/ml接种于75cm~2培养瓶中培养至对数生长期,常规消化,接种于96孔培养板,每孔接种细胞数2×10~4个。12h后吸弃培养液,随机分为六组,每孔分别加入不同浓度的AZT及培养液,使各孔最终体积为2ml。实验组1(100μmol/LAZT)、实验组2(150μmol/LAZT)、实验组3(200μmol/LAZT)、实验组4(250μmol/LAZT)、实验组5(300μmol/LAZT),作用12、24、48h,同时用等体积DMEM培养液及DMSO替代AZT设为空白对照组,同一浓度组接种5个复孔。取各实验组及对照组细胞进行以下检测:以细胞形态学观察评价AZT对C6细胞增殖活性及生长速度的影响;以MTT法检测C6细胞存活率,计算出AZT作用的最佳时间和浓度;以流式细胞术(FCM)和TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测不同浓度AZT作用不同时间对C6细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:1、AZT处理后的细胞形态学观察,用倒置显微镜观察AZT处理后的C6胶质瘤细胞,发现随着药物作用时间及浓度的增加,C6胶质瘤细胞开始逐渐变圆浮起,折光度降低,细胞间连接松散,密度稀疏,增殖减慢。2、MTT法检测不同浓度的AZT在不同时间点对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用,不同浓度端粒酶抑制剂AZT作用于C6胶质瘤细胞,随着抑制剂作用浓度增加、作用时间的延长,肿瘤细胞存活率逐步降低。与对照组相比,100μmol/L的AZT在12h时,对C6胶质瘤细胞的增殖就有明显的抑制作用(p<0.05),其抑制率为7.2%,当AZT浓度达到250μmol/L和300μmol/L作用48h时,其对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用更加显著(p<0.01),它们的抑制率分别达到了48.7%和56.8%。计算IC50值约为269μmol/L。实验结果表明,随着AZT的浓度及作用时间的增加,其抑制C6胶质瘤细胞的增殖作用逐渐增强,呈时间-剂量依赖关系。通过测得的OD值计算出,AZT作用C6胶质瘤细胞的最佳时间是48h,最佳浓度是269μmol/L。3、流式细胞术检测AZT对C6胶质瘤细胞的细胞凋亡和细胞周期的影响,流式细胞仪细胞分析结果显示,当AZT为100μmol/L,48h时即可出现凋亡峰,细胞凋亡率为(11.63±1.115)%,G0/G1期细胞比例增加,S期及G2/M期细胞略有增加。当AZT为300μmol/L,48h时出现明显的凋亡峰,细胞凋亡率为(45.17±2.566)%,与对照组相比,G0/G1期细胞由(77.23±0.702)%下降至(46.97±0.862)%,S期细胞由(7.77±1.06)%增加至(33.07±1.121)%。考虑端粒酶抑制剂AZT有效的抑制了端粒酶活性,可能参与了部分细胞周期和细胞凋亡的调控。4、缺口末端标记法检测AZT(IC50)作用C6胶质瘤细胞48h时细胞的凋亡情况,结果显示C6胶质瘤细胞经浓度为250μmol/L的AZT处理48h后,凋亡细胞阳性率为27%,坏死细胞阳性率仅为1.4%。对照组细胞凋亡率仅为5.4%,细胞坏死率为0.9%。结论:1.在体外实验中AZT对C6胶质瘤细胞有增殖抑制作用,其抑制作用与AZT的时间-剂量呈依赖关系。2.流式细胞仪检测显示:AZT作用于C6胶质瘤细胞后,细胞周期的改变主要表现为S期细胞比例增多,并伴有凋亡细胞的增多,提示AZT对C6胶质瘤细胞的作用可能为作用于细胞的S期,从而参与细胞凋亡。3.TUNEL法检测的结果显示:AZT在体外实验中对C6胶质瘤细胞的作用可能主要以诱导细胞凋亡为主,具体作用机制尚待进一步研究。4.本实验结果为AZT作为以端粒酶为靶点的脑胶质瘤治疗提供了实验依据。

全文目录

缩略语一览表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-16
材料与方法  16-25
  一、实验仪器、试剂及其配制  16-17
    1.主要实验仪器  16-17
    2.主要试剂  17
    3.主要试剂的配制  17
  二、实验方法  17-25
    1. 细胞培养  18
      1.1 细胞的冻存与复苏  18
      1.2 细胞处理和标本制备  18
    2. MTT法检测AZT对C6胶质瘤细胞存活率的影响  18-20
    3. 流式细胞术检测细胞凋亡与细胞周期  20-22
    4. TdT介导的dUTPE缺口末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡  22-24
      4.1 试剂配制  23
      4.2 实验步骤  23-24
    5. 统计学原理  24-25
结果  25-34
  1. 倒置显微镜下观察细胞生长状态  25-26
  2. MTT法检测端粒酶抑制剂AZT的浓度、作用时间与C6胶质瘤细胞抑制率的关系  26-28
  3. 流式细胞仪检测端粒酶抑制剂AZT的浓度对C6胶质瘤细胞凋亡与细胞周期的影响  28-32
  4. TUNEL法检测C6胶质瘤细胞凋亡情况  32-34
讨论  34-40
结论  40-41
参考文献  41-45
综述  45-52
  参考文献  50-52
论文发表情况  52-53
致谢  53

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