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众所周知药物研发是一个风险高、投资大、周期长的过程。在药物研发的临床前阶段,毒性问题是决定研发成功与否的主要问题之一,因此在药物研发早期,严格淘汰因毒性问题不适合进一步研发的化合物有助于降低投资风险、节约成本。如何在研发早期尽早发现候选化合物的潜在毒性,从而加快药物研发进程、降低药物研发费用、提高研发成功率成为了毒理学研究的重要方向。近年来,随着肿瘤患者的生存期延长,抗肿瘤药物的远期不良反应也日益受到重视。生殖细胞由于增殖迅速,易受到抗肿瘤药物的影响,抗肿瘤药物在有效杀死肿瘤细胞的同时,常会引起生精细胞的大量死亡,导致男性生精功能不同程度的损害,甚至不育。因此外源性化合(药)物的生殖毒害作用逐渐引起人们的关注。MC004是化学合成的雷公藤甲素衍生物,初步药效学筛选其具有抗瘤谱广,抗瘤活性强,水溶性好等优点,具有良好的开发前景。目前MC004正处于早期研发阶段,其一般毒性、毒性作用靶器官、毒性作用机制均未开展系统研究,同时作为雷公藤甲素的衍生物,其生殖毒性也受到广泛关注。本课题采用发现毒理学的短期毒性优化筛选技术和大鼠体内28 d隔日给药亚急性毒性试验相结合的方法对MC004的早期毒性进行研究,探讨其毒性作用特征、靶器官;并对其生殖毒性及可能的机制进行探讨,为MC004作为新型抗肿瘤化合物的研发提供毒理学依据。利用短期毒性优化筛选技术研究MC004的早期毒性发现:一般毒性方面,上下法急性毒性试验检测MC004对雌性小鼠的LD50为2.0 mg/kg(1.92～2.42 mg/kg),染毒后大约4小时出现中毒症状,死亡一般发生在染毒后24～60小时之间;MTT法及LDH漏出率检测MC004对HepG2、HK-2细胞的细胞毒性,随着染毒浓度的升高,MC004对两种细胞的抑制率均逐渐升高,并导致两种细胞膜损伤,通透性升高,胞内LDH漏出率呈时间和剂量依赖性显著升高,MC004与HepG2、HK-2细胞作用48 h的IC50值分别为0.81μM和0.042μM。遗传毒性方面,Ames试验结果表明MC004在1.0、10.0、100.0、500.0、1000.0和2000.0μg/皿受试浓度下,无论有无S9活化系统,对TA97和TA102两种菌株均未显示致突变性。生殖毒性方面,采用孕13 d大鼠胚胎中脑细胞微团培养检测MC004的体外致畸性,结果表明MC004可以双重抑制中脑细胞的分化和增殖,阻止神经细胞分化和集落的形成,呈现剂量—效应关系。MC004对中脑细胞增殖和分化的半数抑制浓度(ICP50和ICD50)分别为0.1963和0.0624μg/ml,两者的比值为3.1,提示MC004可能具有潜在的体外致畸作用。整体动物毒性试验表明,雄性Wistar大鼠分别隔日尾静脉注射MC004 0.25、0.50、0.75 mg/kg 28 d后,各组动物活动未见异常,但给药组尤其是高剂量组动物体重增长明显缓慢,至给药第19 d时,高剂量组大鼠体重与对照组相比明显降低。血液学检查发现,RBC、HGB、HCT含量均呈剂量依赖性下降,RDW呈剂量依赖性升高,高剂量组WBC计数显著降低,表明MC004对血液系统有一定的毒性;血浆生化指标检查发现,表征肝功能的ALT、AST、ALP及TBIL等指标及表征肾功能的CREA、BUN均未见明显改变,尿液检查各项指标也未发现明显变化,肝脏脏器系数及组织病理学检查均未见明显改变;虽然肾脏重量及脏器指数呈剂量依赖性下降趋势,但仅高剂量组明显降低,且肾脏组织病理学检查未见明显改变。因此在本试验条件下,MC004未能导致肝肾功能明显损伤。在生殖毒性方面,我们检测了MC004对雄性大鼠生殖器官、生殖细胞和睾丸标志酶的影响,并检测了雄性大鼠染毒后对雌性大鼠生育能力的间接影响。结果发现:①MC004可致雄性大鼠睾丸、附睾和附睾尾重量及其脏器系数均呈剂量依赖性降低,各剂量组与溶剂对照组比较均有非常显著性差异,组织学检查发现,染毒组大鼠睾丸萎缩,曲细精管管腔内各级生精细胞排列紊乱、细胞层数明显减少,胞间紧密连接消失,部分生精细胞空泡变,腔内精子减少或消失,管腔内可见脱落细胞;附睾管腔内精子及分泌物减少,可见脱落的细胞。②在精子数量、质量和形态方面,各剂量组大鼠精子密度、精子数量均显著降低;活动精子数、活动精子百分率、快速运动精子百分率均呈剂量依赖性下降,同时表征精子运动活力的VAP、VSL和VCL均呈剂量依赖性下降,中、高剂量组ALH、BCF明显降低,高剂量组STR、LIN显著降低;低、中、高剂量组精子畸形率分别达到18.9%、23.1%和21.8%,与对照组相比显著升高,其中以无定形、折尾、无钩的畸形精子为主,其次为短尾、双头/双尾畸形精子。③对睾丸特异性标志酶检测发现,雄性大鼠隔日尾静脉注射MC004 28 d后,睾丸标志酶LDH、LDH-x、ACP均呈剂量依赖性下降,与对照组比较均有显著性或非常显著性差异;MC004各剂量组SDH均下降,与对照组比较均有非常显著性差异。提示MC004可以导致大鼠睾丸生精细胞能量生成不足,阻碍精子获能,从而干扰生精过程。④雄性大鼠在第10次给药后与正常雌性未生育大鼠1:1交配,交配后,与各剂量组MC004染毒的雄性大鼠对应的雌鼠体重增长缓慢,尤其是与高剂量组雄性大鼠交配的雌鼠,可能与受孕率降低有关;与MC004高剂量组(0.75 mg/kg)交配的雌鼠受孕率、生育率显著降低;妊娠第15天剖杀孕鼠,子宫连胎重、子宫重、胎盘重均呈剂量依赖性降低,卵巢重量也呈下降趋势,平均着床数,活胎窝数,总活胎数,窝均活胎数,活胎率均呈剂量依赖性下降,着床前死亡率和着床后死亡率则呈剂量依赖性升高。表明MC004可以通过影响雄鼠的生殖能力来间接影响雌性大鼠的妊娠发育状况,并对早期胚胎发育产生明显影响。对MC004的生殖毒性作用机制研究发现:在0.0012～5μg/ml浓度范围内,MC004可以呈剂量、时间依赖性地引起睾丸生精细胞—支持细胞(S-G细胞)共培养体系中生精细胞脱落率升高。MC004对大鼠原代S-G细胞共培养的IC50值为0.18μg/ml,MC004对大鼠单纯支持细胞的IC50值为1.84μg/ml,二者相差10倍左右,表明支持细胞和生精细胞对MC004的毒作用敏感程度不同,生精细胞首先受到损害,支持细胞的耐受性相对较强。此外MC004可以呈剂量依赖性导致支持细胞LDH漏出率升高,说明支持细胞膜受损,通透性增高。雄性Wistar大鼠单次尾静脉注射MC004 0.25 mg/kg或每日一次,连续三次,均于给药结束24 h后剖杀,结果显示给药3次后,睾丸重量及脏器系数均显著降低,病理学检查发现,睾丸内生精细胞减少,个别生精细胞固缩,单次给药组未发现上述变化;TUNEL染色显示单次给药剂量组睾丸可见明显的生精细胞凋亡,三次给药剂量组生精细胞凋亡数量与对照组相比明显增加;此外,对照组大鼠睾丸生精细胞自发凋亡主要发生在精原细胞,MC004处理后的大鼠睾丸,TUNEL阳性细胞主要为初级和次级精母细胞,表明MC004诱导生精细胞凋亡具有细胞特异性。综上所述,MC004对血液系统具有潜在的毒性作用并具有明确的生殖毒性,其主要的毒作用靶器官为睾丸,0.25 mg/kg剂量下即可导致睾丸萎缩,曲细精管管腔内各级生精细胞排列紊乱、细胞层数明显减少,胞间紧密连接消失,部分生精细胞空泡变,并显著降低睾丸特异性标志酶LDH-x、ACP、SDH活性,造成睾丸能量代谢障碍,不能提供精子发生、生存的能量,导致大鼠精子数量下降、活动度降低和精子形态异常,生育能力降低。此外MC004还可以通过影响雄鼠的生殖能力来间接影响雌性大鼠的妊娠发育状况,并对早期胚胎发育产生明显影响。生精细胞和支持细胞间的相互作用被破坏,导致生精细胞脱落,可能是MC004引起睾丸和附睾萎缩、精子数量减少、质量下降的重要原因,而能量代谢障碍、生精细胞异常凋亡是干扰支持细胞和生精细胞间联系的可能作用机制。尽管如此,作为抗肿瘤化合物,MC004的开发前景应结合其药效学剂量、药代动力学参数及临床适用患者等因素综合评估。
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