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北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用

作　者: 甘琴华
导　师: 郑用琏
学　校: 华中农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 玉米丝轴黑粉菌遗传多样性遗传分化 GFP 根癌农杆菌介导转化
分类号: S435.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本研究利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析了北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性和遗传分化,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,将外源gfp基因导入玉米丝轴黑粉菌并成功表达。获得的主要结果如下:1.筛选出26个扩增稳定、带纹清晰的RAPD引物,对从玉米丝黑穗病发生严重的大部分北方省市收集分离的68个玉米丝轴黑粉菌菌株进行了DNA遗传多样性分析,结果表明,RAPD谱带多态性为98.33%,北方玉米丝轴黑粉菌具有丰富的遗传多样性,遗传分化明显;种群内遗传变异小于种群间遗传变异。玉米丝轴黑粉菌遗传分化除明显受地理阻隔影响外,也可能与玉米种子调运过程中携带病菌基因的遗传迁移相关。2.利用NTSYS软件进行系统聚类分析表明,相似系数为0.76阀值时,68个菌株可划分为13个类群。研究结果完善和丰富了我国玉米丝轴黑粉菌遗传多样性评价研究,对玉米抗病资源筛选和抗病育种具有重要参考价值。3.构建带有报告基因gfp的重组双元质粒载体pCAMBIA0611,利用热击法导入根癌农杆菌,并成功实现了对玉米丝轴黑粉菌的转化。4.对不同的根癌农杆菌菌株、不同的玉米丝轴黑粉菌担孢子成熟度、不同的根癌农杆菌浓度等转化条件的比较研究,建立了根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化体系,结果表明根癌农杆菌GV3101介导,玉米丝轴黑粉菌担孢子在CM中培养3d,根癌农杆菌菌液OD₆₀₀值为0.4左右时,转化效率最高,能达到280个转化子/10⁶个细胞。5.将转化菌株与野生型菌株混合于PD液体中摇床培养,显微镜检发现两者能彼此结合,产生双核菌丝。说明外源基因的插入没有导致与交配结合相关的基因发生突变。6.利用注射法将结合的双核菌液接种于玉米自交系黄早四,二叶一心期PCR检测叶片表明转化菌株侵入到玉米叶片中,说明转化菌株对玉米具有一定的侵染力。成熟期田间能观察到发病植株,并有玉米丝轴黑粉菌冬孢子产生,表明转化菌株具有一定的致病性,侵染植株后能导致发病。7.田间发病植株雄穗小穗切片观察,能观察到玉米组织细胞间隙有明显的菌丝存在。荧光共聚焦显微镜观察,发现菌丝在玉米植株体内能产生绿色荧光。从而为跟踪菌丝的繁殖、扩展,研究抗病机理提供了新的研究手段。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
部分缩略语表  12-13
前言  13-23
  1 玉米丝黑穗病的研究进展  13-16
    1.1 玉米丝黑穗病的分布与危害  13
      1.1.1 玉米丝黑穗病在我国的分布  13
      1.1.2 玉米丝黑穗病的危害  13
    1.2 玉米丝黑穗病病原菌的生理小种分化  13-14
    1.3 玉米丝黑穗病的症状与鉴定方法  14-16
      1.3.1 症状  14-15
      1.3.2 鉴定方法  15-16
    1.4 玉米丝黑穗病病原菌的侵染机制研究  16
  2 随机扩增多态性DNA(RAPD)研究进展  16-18
    2.1 RAPD技术简介  16-17
    2.2 RAPD技术在真菌研究中的应用  17-18
  3 真菌的遗传转化研究进展  18-20
    3.1 根癌农杆菌介导的真菌的遗传转化  18-19
      3.1.1 根癌农杆菌介导转化真菌的分子生物学原理  18
      3.1.2 影响转化的因素  18-19
      3.1.3 根癌农杆菌介导的遗传转化在真菌中的应用  19
    3.2 真菌的原生质体转化  19-20
      3.2.1 影响原生质体转化的因素  19-20
      3.2.2 原生质体转化在真菌中的应用  20
  4 绿色荧光蛋白(GFP)作为生物标记在病原真菌中的应用  20-21
  5 本课题研究的目的和意义  21-23
第一章北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性研究  23-36
  1 材料与方法  23-27
    1.1 材料  23
    1.2 方法  23-27
      1.2.1 玉米丝轴黑粉菌的分离  23-24
      1.2.2 DNA的提取及纯化  24-25
      1.2.3 DNA的检测  25
      1.2.4 PCR反应  25-26
      1.2.5 电泳检测和数据处理  26-27
  2 结果与分析  27-33
    2.1 玉米丝轴黑粉菌的特异引物检测  27
    2.2 丝轴黑粉菌的遗传多态性分析  27-28
    2.3 种群间遗传距离和遗传相似性  28
    2.4 种群间遗传分化  28-30
    2.5 基因流的影响  30
    2.6 种群和个体间遗传聚类关系  30-32
    2.7 主坐标分析  32-33
  3 讨论  33-36
第二章根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化  36-49
  1 材料与方法  36-43
    1.1 材料  36
      1.1.1 质粒载体  36
      1.1.2 菌株  36
    1.2 方法  36-43
      1.2.1 含重组质粒的农杆菌的制备与培养  36-41
        1.2.1.1 高效启动子gpd的扩增  36-37
        1.2.1.2 含高效启动子trpC，gpd的双元载体的构建  37-40
        1.2.1.3 质粒的大肠杆菌转化  40
        1.2.1.4 质粒的提取和鉴定  40-41
        1.2.1.5 质粒的根癌农杆菌转化  41
        1.2.1.6 农杆菌质粒酶切鉴定  41
      1.2.2 根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的遗传转化  41-43
        1.2.2.1 潮霉素抑制玉米丝轴黑粉菌生长的最低浓度的筛选  41
        1.2.2.2 根癌农杆菌介导的玉米丝轴黑粉菌的转化  41-42
        1.2.2.3 转化子的PCR鉴定  42
        1.2.2.4 用于转化的根癌农杆菌最佳菌株的筛选  42
        1.2.2.5 用于转化的丝轴黑粉菌担孢子最佳成熟度的筛选  42
        1.2.2.6 用于转化的根癌农杆菌最佳浓度的筛选  42-43
  2 结果与分析  43-47
    2.1 扩增GPD启动子序列测序结果分析  43
    2.2 含trpC启动子载体的构建及鉴定  43-44
    2.3 潮霉素抑制玉米丝轴黑粉菌生长的最低浓度的筛选  44
    2.4 转化子的潮霉素筛选  44-45
    2.5 转化子的PCR鉴定  45
    2.6 用于转化的根癌农杆菌最佳菌株的筛选  45-46
    2.7 用于转化的丝轴黑粉菌担孢子最佳成熟度的筛选  46
    2.8 用于转化的根癌农杆菌最佳浓度的筛选  46-47
  3 讨论  47-49
第三章转化GFP菌株侵染玉米  49-55
  1 材料与方法  49-51
    1.1 材料  49
      1.1.1 植物材料  49
      1.1.2 菌株  49
    1.2 方法  49-51
      1.2.1 植物材料的准备  49
      1.2.2 转化菌株配对  49-50
      1.2.3 二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察  50
      1.2.4 幼苗期接种  50
      1.2.5 苗期PCR检测  50
      1.2.6 成熟期冬孢子检测  50
      1.2.7 切片制备  50
      1.2.8 普通显微镜镜检  50-51
      1.2.9 荧光共聚焦显微镜(LSCM)观察  51
  2 结果与分析  51-53
    2.1 DAPI染色观察  51
    2.2 幼苗期PCR检测  51-52
    2.3 玉米成熟期田间取样观察结果  52
    2.4 切片普通显微镜镜检结果  52
    2.5 切片荧光共聚焦显微镜镜检  52-53
  3 讨论  53-55
总结  55-60
参考文献  60-66
致谢  66-67
附录1 试剂和培养基制备  67-69
附录2 大肠杆菌电转化感受态的制备  69-70
附录3 质粒的大肠杆菌转化  70
附录4 根癌农杆菌感受态的制备  70-71
附录5 质粒的根癌农杆菌转化  71
附录6 凝胶回收DNA片段(TaKaRa)  71-72
附录7 碱裂解法提取质粒(小样法)  72-73
附录8 大样法抽提高浓度质粒  73
附录9 用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)进行DNA样品的纯化  73-74
附录10 PCR产物的纯化  74
附录11 克隆gpd序列比对结果  74-78

北方玉米丝轴黑粉菌的遗传多样性评价及GFP基因在病理学研究中的应用

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